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研究目的:观察川芎嗪对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞通透性变化和骨架相关蛋白以及微小RNA的表达影响,探讨转录后水平可能的调控机制。研究方法:0.25%胰酶消化并分离出HUVECs进行原代培养,经Ⅷ因子抗体免疫组织化学法鉴定血管内皮细胞。CCK8法检测川芎嗪对HUVECs的安全浓度范围。从安全范围内选择呈梯度增高的三组药物浓度作为治疗组,细胞随机分7组:正常对照组、LPS损伤组(1μg/ml)、TMP低剂量保护组(TMP 60μg/ml+LPS 1μg/ml)、TMP中剂量保护组(TMP 120μg/ml+LPS 1μg/ml)、TMP高剂量保护组(TMP 240μg/ml+LPS 1μg/ml)、纯TMP组(TMP 240μg/ml)、法舒地尔组(法舒地尔3.25μg/ml+LPS 1μg/ml)。Transwell小室内建立内皮细胞通透性模型;细胞电压电阻仪测定各组细胞跨内皮细胞电阻值;通过异硫氰酸萤光素一右旋糖酐法检测各组细胞通透性变化;免疫荧光骨架染色检测各组细胞骨架变化情况。采用Rac1Pull-Down Assay实验下拉Rac1-GTPase活性蛋白。Western blot检测HUVECs各组细胞Rac1-GTPase活性蛋白和Rac1、LIMK1、p-LIMK1的蛋白表达;高通量测序技术检测正常对照组、LPS损伤组、TMP高剂量保护组的mi RNAs差异性表达;Real-time PCR检测各组细胞Rac1、LIMK1 m RNA水平及验证mi R-143-3p、mi R-194-5p mi RNA表达差异性。研究结果:1.TMP浓度在0-240μg/ml范围内时,对LPS诱导的HUVECs细胞活性下降有显著的改善,TMP药物浓度超过480μg/ml范围时,TMP药物本身对HUVECs的细胞活性产生抑制作用。2.LPS可以导致内皮细胞形态改变,应力纤维增多增粗,微丝明显着色,细胞间紧密性明显破坏,细胞间隙增大;在能够有效改善LPS诱导的HUVECs细胞活性下降的TMP浓度范围内,随着TMP浓度升高,细胞内微丝着色逐渐降低,应力纤维逐渐减少、变细,紧密连接逐渐回复。细胞形态学观察发现,TMP药物浓度在30μg/ml以下时并未对LPS诱导的HUVECs骨架重构产生明显的保护作用。3.TMP对LPS诱导的HUVECs的屏障功能破坏具有一定的保护作用。应用跨内皮细胞电阻值(TEER)及通透系数(Pa)检测,结果显示三组不同浓度的TMP(60μg/ml、120μg/ml、240μg/ml)均可以抑制LPS诱导的内皮细胞TEER降低以及降低LPS导致的内皮细胞通透性的增加(P<0.05)。4.Western blot实验证实了TMP可以有效抑制LPS诱导的HUVECs中的Rac1-GTPase、p-LIMK1、Rac1、LIMK1表达上调(P<0.05)。5.高通量测序结果:LPS组同时与正常对照组和TMP高剂量保护组比较,具有明显差异(P<0.05)的mi RNA共59个,其中在LPS组中表达下调同时在TMP高剂量保护组中表达上调的mi RNA共有29个;在LPS组中表达上调同时在TMP高剂量保护组中表达下调的mi RNA共有30个。6.q PCR结果显示:TMP抑制LPS诱导的HUVECs中Rac1、LIMK1 m RNA水平的下调(P<0.05)以及mi R-143-3p、mi R-194-5p的上调(P<0.05)。结合其蛋白水平的表达情况来看,TMP对Rac1/LIMK1信号通路的调控可能来自于转录后水平。结论:1.川芎嗪可以有效抑制脂多糖诱导的HUVECs通透性升高;2.川芎嗪减轻脂多糖诱导的HUVECs细胞骨架损伤的机制可能与其下调Rac1/LIMK1信号通路中Rac1-GTPase活性蛋白、LIMK1磷酸化蛋白表达有关;3.LPS能够降低内皮细胞中mi R-143-3p、mi R-194-5p的表达;4.川芎嗪可能通过调控mi R-194-5p、mi R-143-3p影响LPS诱导的内皮细胞中Rac1、LIMK1蛋白表达变化。