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牛病毒性腹泻病(Bovine viral disease, BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起牛的一种多临床症状的传染病,目前呈世界性分布,给养牛业造成巨大的经济损失。BVDV分为基因1型(BVDV-1)和基因2型(BVDV-2)。自20世纪80年代末,BVDV-2首次分离于加拿大和美国爆发急性的BVD中。BVDV-2主要引起腹泻,免疫耐受与持续性感染,先天性缺陷,母畜流产、产死胎和畸形胎等;高毒力的BVDV-2还能引起血小板减少症和出血综合症。BVDV-1在我国牛群中流行普遍,2009年BVDV-2首次在我国分离报道。因此,本研究将集中如下两部分:一、制备抗BVDV单克隆抗体,基于生物素-亲和素系统建立双抗体夹心ELISA检测方法;二、对分离鉴定的BVDV-2 XJ-04株全基因组序列进行测序分析及基因分型。上述研究旨在为我国牛病毒性腹泻病的分子流行病学研究和诊断方法奠定基础。研究一:采用分段RT-PCR方法扩增BVDV-2 XJ-04株的18个片段,分别为A-Q、5’和3’-UTR部分序列。除了5’和3’-UTR部分序列外,内侧的17个基因片段末端相互重叠;5’和3’-UTR部分序列是在RNA连接酶作用下将RNA5’和3’端自我连接后进行RT-PCR扩增。将各序列进行拼接后成功获得了BVDV-2 XJ-04株的全长为12,284bp的全基因组序列,并在GenBank中进行注册,登录号为FJ527854。通过5’-UTR及全基因组序列进化树分析,并结合自我裂解酶(Npro)及结构蛋白(C、Erns、E1、E2)与标准株NADL(BVDV-1)和890(BVDV-2)进行核苷酸及氨基酸序列同源性比较分析,结果表明XJ-04与890、NewYork93的亲缘关系最近,归入BVDV-2a亚型。研究二:将经PEG浓缩、蔗糖垫底纯化的890毒株(BVDV-2)作为制备单克隆抗体的免疫原;免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,以pET28a-BE2的原核表达产物BE2为检测抗原进行间接ELISA筛选,得到1株分泌性能稳定、抗体分子类为IgG、腹水ELISA滴度为1:216的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,命名为3F9。3F9对猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、1型牛疱疹病毒(Bovine herpes virus-1, BHV-1)、牛轮状病毒(Bovine rota virus, BRV)均无交叉反应,显示3F9具有良好的特异性。利用该单克隆抗体的高特异性以及Biotin-avidin system(BAS)系统的灵敏性,设计了一种灵敏度高、特异性强的检测BVDV的双抗体夹心ELISA方法,单克隆抗体IgM为捕获抗体,biotin标记的3F9作为第二抗体。方阵滴定实验确定捕获抗体最佳工作浓度为2μg/mL,Biotin-3F9工作效价为60ng/mL,BE2最低检出量为84ng/mL。建立双抗体夹心ELISA方法检测35份病牛血清样本,13份为阳性;与RT-PCR的符合率达到94.29%;表明本研究所建立的BAS-ELISA方法可用于BVDV感染的临床诊断。这为BVDV的免疫学研究和临床诊断提供技术基础。