目的:本实验基于中医藏象理论核心内容之一的“肾藏精主骨生髓”理论,根据阴阳学说“阴阳互济”的原则选取中医经典补肾益精方剂左、右归丸,通过基于细胞自噬的角度,探索左、右归丸对去卵巢大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal mesenchumal cells,BMSCs)成骨、成脂分化的影响,揭示了左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs自噬的影响。材料与方法:SPF级2月龄SD雌性未生育大鼠65只,随机分为6组,分别是空白对照组(KB)、模型组(OVX)、假手术组(SHAM)、左归丸组(ZGW)、右归丸组(YGW)和补佳乐组(BJL)。适应性喂养7d后,采用双侧去卵巢法建立绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis,PMOP)模型,术后观察7d,灌胃饲养,按人与大鼠体表面积折算等效剂量比值计算灌胃量,每日定时灌胃1次,连续灌胃12w,采用全骨髓贴壁法提取去去卵巢大鼠股骨及胫骨BMSCs,培养至P3代,采用流式细胞仪鉴定BMSCs,采用MTT(噻唑蓝)比色法检测各组细胞增殖率。采用Wesrern blot方法检测自噬相关蛋白Beclin1和P62(Sequestosome-1,SQSTM1)的表达,采用免疫荧光法检测各组细胞自噬相关指标LC3的表达。采用MTT比色法,利用KB组的P3代细胞筛选自噬经典诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)对于BMSCs自噬诱导的最佳作用浓度及最佳作用时间,并采用Wesrern blot方法检测自噬相关蛋白Beclin1和泛素结合蛋白P62的表达来确定雷帕霉素的作用浓度及作用时间,采用免疫荧光法检测自噬诱导后自噬相关指标LC3的表达。对BMSCs分别进行成骨及成脂诱导,成骨分化后的细胞分别采用ELISA法、PNPP法检测各组细胞碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性,采用改良钙钴染色法观察细胞内ALP的表达,采用茜素红染色法观察细胞矿化结节的形成。采用Wesrern blot方法检测成骨相关蛋白I型胶原(Collagen I,COLI)和核心结合因子(Runt-related transcription factor 2,Runx2)的表达,检测自噬相关蛋白Beclin1、P62、微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated Protein 1-Light Chain3,LC3)的表达,采用免疫荧光法检测各组细胞成骨分化后自噬相关指标LC3的表达。成脂分化后的细胞采用油红O染色法观察细胞中的棕红色脂滴的形成,采用Wesrern blot方法检测成脂相关蛋白过氧化物酶增殖物激活酶(Peroxisome proliferator-acticvated receptor,PPARγ)和脂蛋白酯酶(lipoprtein lipase,LPL)的表达,检测自噬相关蛋白Beclin1、P62、LC3的表达,采用免疫荧光法检测各组细胞成脂分化后自噬相关指标LC3的表达。结果:1左、右归丸与去卵巢大鼠BMSCs增殖的研究1.1 BMSCs的鉴定提取细胞原代并培养至P3代,采用流式细胞仪鉴定2种阳性细胞表面因子CD29及CD90,1种阴性细胞表面因子CD11b/c。其中CD29和CD90表达率为:92.9%。CD 11b/c表达率为34.0%。结合倒置显微镜下观察细胞形态和细胞流式鉴定结果,确定本实验提取的细胞为BMSCs。1.2BMSCs的生长曲线和左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs增殖的影响1.2.1BMSCs的生长曲线结果显示,BMSCs生长曲线呈S型,细胞接种后的前72h为潜伏期,72h后细胞开始进入对数期,第168h细胞生长达到平台期。1.2.2BMSCs的增殖结果显示,与KB组相比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组的细胞增殖率明显降低(P<0.05);与OVX组相比较,3个给药组的细胞增殖率均升高(P<0.05);与BJL组相比,ZGW组无显著性差异(P>0.05),YGW组细胞增殖率明显降低(P<0.05)。2左、右归丸与去卵巢大鼠BMSCs成骨与成脂分化的研究2.1左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成骨诱导的影响2.1.1成骨相关指标ALP的表达2.1.1.1PNPP法结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组ALP活性明显降低(P<0.05);与OVX组相比较,3个给药组均可增强去卵巢大鼠BMSCs ALP活性(P<0.05),且ZGW组效果最佳;与BJL组比较,ZGW组ALP活性明显升高(P<0.05),YGW组ALP活性明显降低(P<0.05);各组于10d时ALP活性最高。以上结果说明,左、右归丸均有利于去卵巢大鼠BMSCs向成骨方向分化,且左归丸效果优于右归丸。2.1.1.2ELISA法结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组ALP表达明显降低(P<0.05);与OVX组相比较,3个给药组的ALP表达均显著升高(P<0.05),且ZGW组最为明显;与BJL组相比较,ZGW组无明显差异(P>0.05),YGW组ALP表达明显降低(P<0.05)。以上结果说明,左、右归丸均有利于去卵巢大鼠BMSCs向成骨方向分化,且左归丸效果优于右归丸。2.1.1.3改良钙钴染色法结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异,OVX组在镜下可观察到棕黄色颗粒明显减少;与OVX相比,3个给药组在镜下可观察到棕黄色颗粒明显增多,且ZGW组最为明显;与BJL组相比,ZGW组无明显差异,YGW组棕黄色颗粒明显减少。以上结果说明,左、右归丸均能增强去卵巢大鼠BMSCs成骨分化后ALP的表达,且左归丸效果优于右归丸。2.1.2左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成骨诱导后矿化结节形成的影响结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异,OVX组在镜下可观察到棕红色矿化结节明显减少;与OVX相比,3个给药组在镜下可观察到棕红色矿化结节明显增多,且ZGW组最为明显;与BJL组相比,ZGW组棕红色矿化结节明显增多,YGW组棕红色矿化结节明显减少。以上结果说明,左、右归丸均能促进去卵巢大鼠BMSCs成骨诱导后矿化结节的形成,且左归丸效果优于右归丸。2.1.3左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成骨分化后COL I和Runx2蛋白表达的影响2.1.3.1COL I蛋白的表达结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组COLI蛋白表达水平降低(P<0.05);与OVX组比较,3个给药组COLI蛋白水平皆有提高(P<0.05),且ZGW组最为明显;与BJL组相比较,ZGW组无明显差异(P>0.05),YGW组COLI蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。以上结果说明,左、右归丸均能通过提高成骨相关指标COLⅠ的表达促进去卵巢大鼠BMSCs成骨分化,且左归丸效果优于右归丸。2.1.3.2Runx2蛋白的表达结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05);与OVX组比较,ZGW组、BJL组Runx2蛋白表达水平皆有提高(P<0.05);与BJL组相比较,ZGW组无明显差异(P>0.05),YGW组Runx2蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。以上结果说明,左归丸能通过提高成骨相关指标Runx2的表达促进去卵巢大鼠BMSCs成骨分化。2.2左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成脂诱导的影响2.2.1左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成脂诱导后脂滴形成的影响结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异,OVX组在镜下可观察到脂滴明显增多;与OVX相比,YGW组在镜下可观察到脂滴明显增多,ZGW组、BJL在镜下可观察到脂滴明显减少;与BJL组相比,ZGW组脂滴明显减少,YGW组脂滴明显增多。以上结果说明,左归丸降低去卵巢大鼠BMSCs成脂分化能力,右归丸能增强去卵巢大鼠BMSCs成脂分化能力。2.2.2左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成脂分化后PPARγ和LPL蛋白表达的影响2.2.2.1 PPARγ蛋白的表达结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组PPARγ蛋白表达升高(P<0.05);与OVX组比较,ZGW组、BJL组的PPARγ蛋白表达降低(P<0.05),YGW组的PPARγ蛋白表达升高(P<0.05);与BJL组相比较,ZGW组PPARγ蛋白表达明显降低(P<0.05),YGW组PPARγ蛋白表达明显升高(P<0.05)。以上结果说明,左归丸降低去卵巢大鼠BMSCs成脂分化能力,右归丸能增强去卵巢大鼠BMSCs成脂分化能力。2.2.2.2LPL蛋白的表达结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组LPL蛋白表达明显增高(P<0.05);与OVX组比较,ZGW组、YGW组、BJL组的LPL蛋白表达水平皆下降(P<0.05),且YGW组最为明显;与BJL组比较,ZGW组无显著性差异(P>0.05),YGW组LPL蛋白表达明显降低(P<0.05)。以上结果说明,右归丸可通过降低LPL蛋白的表达调节去卵巢大鼠BMSCs成脂分化后的相关脂代谢。3雷帕霉素对大鼠BMSCs自噬诱导的条件筛选3.1MTT法筛选雷帕霉素最佳作用浓度及作用时间结果显示,雷帕霉素可诱导大鼠BMSCs自噬,最佳浓度为2*10-6mol·L-1,最佳作用时间为16h。3.2 Wesrern blot方法检测自噬相关蛋白的表达3.2.1Beclin1蛋白的表达结果显示,与KB组比较,KB+3-MA组、RAPA+3-MA组Beclin1蛋白的表达显著降低(P<0.05),RAPA组Beclin1蛋白的表达显著增强(P<0.05)。与RAPA组比较,RAPA+3-MA组Beclin1蛋白的表达显著降低(P<0.05)。以上结果显示,RAPA可有效诱导BMSCs自噬。3.2.2 P62蛋白的表达结果显示,与KB组比较,KB+3-MA组、RAPA组、RAPA+3-MA组P62蛋白的表达显著增强(P<0.05),RAPA组Beclin1蛋白的表达显著增强(P<0.05);与KB+3MA组比较,RAPA组、RAPA+3-MA组P62蛋白的表达显著降低(P<0.05)。以上结果显示,RAPA可有效诱导BMSCs自噬。3.3免疫荧光法检测自噬相关指标LC3的表达结果显示,与KB组比较,RAPA组可在镜下观察到细胞浆中的荧光点状聚合明显增多(P<0.05);与RAPA组比较,RAPA+3-MA组点状聚合明显减少(P<0.05)。以上结果显示,RAPA可有效诱导BMSCs自噬。4左、右归丸对BMSCs自噬的影响4.1左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs自噬影响4.1.1左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs自噬相关蛋白表达的影响4.1.1.1P62蛋白的表达结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组P62蛋白表达水平升高(P<0.05);与OVX组比较,ZGW组、YGW组、BJL组P62蛋白表达水平皆降低(P<0.05),且ZGW组降低最为明显;与BJL组比较,ZGW组P62蛋白表达降低(P<0.05),YGW组P62蛋白表达升高(P<0.05)。以上结果显示,左、右归丸均可提高去卵巢大鼠BMSCs自噬,左归丸效果更佳。4.1.1.2Beclin1蛋白的表达结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组Beclin1蛋白表达水平显著降低(P<0.05);与OVX组比较,ZGW组、YGW组、BJL组Beclin1蛋白表达水平皆升高(P<0.05),且以ZGW组最为明显;与BJL组比较,ZGW组无显著性差异(P>0.05),YGW组Beclin1蛋白表达明显降低(P<0.05)。以上结果显示,左、右归丸均可提高去卵巢大鼠BMSCs自噬,左归丸效果更佳。4.1.2免疫荧光法检测左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs自噬水平的影响结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组可在镜下观察到细胞浆中的点状聚合减少(P<0.05);与OVX组比较,ZGW组、YGW组、BJL组点状聚合明显增多(P<0.05),且以ZGW组最为明显;与BJL组比较,ZGW组细胞浆中的点状聚合明显增多(P<0.05),YGW组无明显差异(P>0.05)。由此可见,左归丸、右归丸均可促进去卵巢大鼠BMSCs自噬,左归丸效果更佳。4.2左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成骨分化后自噬的影响4.2.1左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成骨分化后自噬相关蛋白表达的影响4.2.1.1P62蛋白的表达结果显示,与KB组比较,OVX组P62蛋白表达水平升高(P<0.05);与OVX组比较,SHAM组、ZGW组、YGW组、BJL组P62蛋白表达水平皆降低(P<0.05),且ZGW组最为明显;与BJL组比较,ZGW组P62蛋白表达降低(P<0.05),YGW组无显著性差异(P>0.05)。以上结果显示,左、右归丸均可提高去卵巢大鼠BMSCs成骨分化后自噬,左归丸效果更佳。4.2.1.2Beclin1蛋白的表达结果显示,与KB组比较,SHAM组、OVX组、YGW组无显著性差异(P>0.05);与OVX组比较,ZGW组、BJL组Beclin1蛋白表达水平显著升高(P<0.05),且ZGW组最为明显;与BJL组比较,ZGW组Beclin1蛋白表达明显升高(P<0.05),YGW组Beclin1蛋白表达明显降低(P<0.05)。以上结果显示,左归丸可促进去卵巢大鼠BMSCs成骨分化后自噬。4.2.1.3 LC3蛋白的表达结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组LC3Ⅱ蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与OVX组比较,ZGW组、YGW组、BJL组LC3Ⅱ蛋白表达水平明显升高(P<0.05),且ZGW组最为显著;与BJL组比较,ZGW组LC3Ⅱ蛋白表达明显升高(P<0.05),YGW组LC3Ⅱ蛋白表达明显降低(P<0.05)。以上结果显示,左、右归丸均可提高去卵巢大鼠BMSCs成骨分化后自噬,左归丸效果更佳。4.2.2免疫荧光法检测左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成骨分化后自噬水平的影响结果显示,与KB组比较,SHAM组、OVX组无显著性差异(P>0.05);与OVX组比较,ZGW组、YGW组、BJL组可在镜下观察到细胞浆中的荧光点状聚合增多(P<0.05),且ZGW组最为明显;与BJL组比较,ZGW组细胞浆中的荧光点状聚合明显增多(P<0.05),YGW组细胞浆中的荧光点状聚合明显减少(P<0.05)。以上结果显示,左、右归丸均可提高去卵巢大鼠BMSCs成骨分化后自噬,左归丸效果更佳。4.3左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成脂分化后自噬的影响4.3.1左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成脂分化后自噬相关蛋白表达的影响4.3.1.1P62蛋白的表达结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组P62蛋白表达水平降低(P<0.05);与OVX组比较,ZGW组、BJL组P62蛋白表达水平升高(P<0.05),YGW组与OVX组无显著性差异(P>0.05);与BJL组比较,ZGW组P62蛋白表达水平升高(P<0.05),YGW组无显著性差异(P>0.05)。以上结果显示,去卵巢大鼠模型组BMSCs成脂分化后自噬水平较高,右归丸可提高去卵巢大鼠BMSCs成脂分化后自噬。4.3.1.2Beclin1蛋白的表达结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组Beclin1蛋白表达水平显著升高(P<0.05);与OVX组比较,ZGW组、BJL组Beclin1蛋白表达水平皆降低(P<0.05),YGW组与OVX组无显著性差异(P>0.05);与BJL组比较,ZGW组无显著性差异(P>0.05),YGW组Beclin1蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。以上结果显示,去卵巢大鼠模型组BMSCs成脂分化后自噬水平较高,右归丸可提高去卵巢大鼠BMSCs成脂分化后自噬。4.3.1.3 LC3蛋白的表达结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组LC3Ⅱ蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与OVX组比较,ZGW组、BJL组LC3Ⅱ蛋白表达水平明显降低(P<0.05),YGW组LC3Ⅱ蛋白表达水平明显升高(P<0.05);与BJL组比较,ZGW组LC3Ⅱ蛋白表达水平明显降低(P<0.05),YGW组LC3Ⅱ蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。以上结果显示,去卵巢大鼠模型组BMSCs成脂分化后自噬水平较高,右归丸可提高去卵巢大鼠BMSCs成脂分化后自噬。4.3.2免疫荧光法检测左、右归丸对去卵巢大鼠BMSCs成脂分化后自噬水平的影响结果显示,与KB组比较,SHAM组无显著性差异(P>0.05),OVX组可在镜下观察到细胞浆中的点状聚合明显增多(P<0.05);与OVX组比较,ZGW组、BJL组可在镜下观察到细胞浆中的点状聚合明显减少(P<0.05),YGW组点状聚合明显增多(P<0.05);与BJL组比较,ZGW组LC3Ⅱ蛋白表达水平明显降低(P<0.05),YGW组LC3Ⅱ蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。以上结果显示,去卵巢大鼠模型组BMSCs成脂分化后自噬水平较高,右归丸可提高去卵巢大鼠BMSCs成脂分化后自噬。结论:1左、右归丸均可促进去卵巢大鼠BMSCs增殖,且左归丸促进去卵巢大鼠BMSCs增殖能力较强。2PMOP的发生与BMSCs成骨、成脂的分化密切相关。左、右归丸均可以调节去卵巢大鼠BMSCs成骨、成脂分化后的相关指标,其中左归丸促进成骨相关指标的表达、抑制成脂相关指标的表达;右归丸可促进成骨相关指标的表达和成脂相关指标的表达;通过比较,左归丸偏于增强BMSCs成骨分化能力,右归丸偏于增强BMSCs成脂分化能力。3自噬经典诱导剂雷帕霉素可有效的诱导大鼠BMSCs自噬,其最佳工作浓度为2*10-6mol·L-1,最佳作用时间为16h。4左、右归丸均可提高去卵巢大鼠BMSCs自噬水平,这可能是左、右归丸促进去卵巢大鼠BMSCs增殖的机制之一。5左归丸可能通过提高去卵巢大鼠BMSCs成骨分化的自噬水平,增强去卵巢大鼠BMSCs成骨分化能力;右归丸可能通过提高去卵巢大鼠BMSCs成脂分化的自噬水平,增强去卵巢大鼠BMSCs成脂分化能力。