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哺乳动物的淋巴管发育主要起源于静脉。在胚胎发育早期,主静脉上的部分内皮细胞分化成淋巴管内皮细胞,先形成初级淋巴囊结构,并通过淋巴管新生过程逐步形成完整的淋巴管网络系统。近年来,随着多种遗传改造小鼠模型的建立和成像技术的进步,有关淋巴管系统发育调控及其在维持体液平衡、血压调节、脂代谢、免疫与炎症、以及肿瘤转移等生理和病理方面的功能也逐渐被揭示。其中,基于Cre/LoxP系统的基因编辑技术使得在特定时间与空间敲除或活化某特定基因变得可控,为深入研究基因的生物学功能及其在疾病发生中的病理机制提供了有效的手段。然而,条件性基因敲除的效率主要取决于Cre重组酶的表达水平与组织特异性,因此制备Cre重组酶转基因小鼠是实施基因可控修饰的重要工具。本项目的主要任务是建立应用于淋巴管研究的CreERT2重组酶转基因小鼠。在胚胎发育早期,血管内皮细胞生长因子受体-3(VEGFR-3)在血管内皮细胞表达,但从妊娠中后期开始主要表达在胚胎的淋巴管内皮细胞。为此,本项目利用基因敲入方法,在Vegfr3终止密码子后插入内部核糖体进入位点(IRES)与CreERT2编码序列(CreERT2融合蛋白由Cre重组酶与带有点突变的人雌激素受体配体结合域组成),以建立可模拟内源VEGFR-3表达分布的CreERT2重组酶转基因小鼠品系。利用Rosa26-m TmG转基因报告鼠与上述新制备的Vegfr3-CreERT2转基因工具鼠交配,获得Vegfr3-CreERT2;Rosa26-mTmG双重转基因小鼠,然后在不同的发育阶段利用他莫西芬诱导CreERT2重组酶的活性,通过检测绿色荧光蛋白(GFP)的表达来验证所制备的Vegfr3-CreERT2转基因工具鼠CreERT2重组酶在组织中的表达分布以及介导同源重组的效率。实验结果表明,在胚胎期,GFP信号在他莫西芬处理小鼠(Vegfr3-CreERT2;Rosa26-mTmG)的腹部皮肤、肠系膜和心脏的淋巴管内皮细胞均有表达,并且在收集淋巴管的瓣膜处清晰可见。此外,我们使用全组织免疫荧光染色方法分别检测了 E12.5,E13.5,E14.5,E16.5和E18.5五个时间点的小鼠左肺GFP信号的分布,由于肺深部组织淋巴管的GFP信号不易被检测到,该研究只展示了胚胎发育过程中左肺浅表层淋巴管网络的形成。在出生后小鼠(Vegfr3-CreERT2;Rosa26-mTmG),他莫西芬处理(出生后1至4天,P1-P4)同样有效诱导了新生鼠(P7)腹部和尾部皮肤、肺部以及气管中淋巴管内皮细胞GFP的表达。与上述结果一致,利用他莫西芬处理3周龄和成年小鼠,可在耳腹侧皮肤、气管和隔膜等多种组织的淋巴管检测到GFP信号,特别是收集淋巴管的瓣膜处有高水平GFP表达。另外,我们也发现,在胚胎期及出生后不同阶段,Vegfr3-CreERT2;Rosa26-mTmG小鼠多种组织器官的部分血管内皮细胞有GFP表达,特别是窦状血管丰富的肝脏中有大量GFP表达,这与已知VEGFR-3在该类血管的表达情况一致;在肠绒毛与视网膜的毛细胞血管中也检测到较多的GFP阳性细胞。有趣的是,在视网膜的静脉和动脉上也发现有少量表达GFP的细胞,提示除毛细血管外的部分大血管内皮细胞也表达VEGFR-3,其生物学意义有待进一步研究。综上所述,本项目成功制备了可在淋巴管表达CreERT2重组酶的转基因工具鼠Vegfr3-CreERT2,并可在不同发育阶段有效诱导报告基因(GFP)在淋巴管内皮细胞表达。另外,与内源性VEGFR-3的表达类似,CreERT2重组酶诱导的GFP表达也可发生在部分血管内皮细胞;VEGFR-3为何只在部分血管内皮细胞表达是一个值得深入研究的有趣问题,因此该小鼠也为分析组织内血管内皮细胞的异质性提供了一个有用的研究工具。