论文部分内容阅读
第一部分:rh GLP-1(7-36)在不同时间点对人肝HL7702细胞系Akt、p70S6K表达的影响目的观察重组人胰高血糖素样肽-1(7-36)[recombinant human glucagon like peptide-1(7-36),rh GLP-1(7-36)]对人肝HL7702细胞系蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、核糖体蛋白S6激酶(ribosomal protein S6 kinase,p70S6K)表达的影响,寻找GLP-1作用的最佳时间点,并探讨其作用机制。方法选用处于对数生长期的人肝HL7702细胞系,用含100 n M浓度rh GLP-1(7-36)的培养基培养。分别于培养的0min、10 min、60 min和90 min时,观察Akt、p-Akt(Ser473)、p-Akt(Thr308)、p70S6K、p-p70S6K(ribosomal protein S6 kinase,Thr389)的蛋白表达水平,上述蛋白表达水平均用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测。结果p-Akt(Thr308)蛋白表达量随rh GLP-1(7-36)作用时间的延长而升高,在90 min时升高最明显(P=0.001);p-p70S6K(Thr389)蛋白表达量也随rh GLP-1(7-36)作用时间的延长而升高,在60 min、90 min时升高显著(P值分别为0.045和0.004);而Akt、p-Akt(Ser473)和p70S6K蛋白表达量在各作用时间点均无明显变化。结论rh GLP-1(7-36)能够刺激人肝HL7702细胞中Akt蛋白和p70S6K蛋白的磷酸化,作用强度随时间的延长而增强,在rh GLP-1(7-36)作用90min时效果最强,该结果为探索GLP-1对人肝细胞的直接作用机制提供依据。第二部分:rh GLP-1(7-36)、他克莫司、rh GLP-1(7-36)+他克莫司对人肝HL7702细胞系Akt/m TOR/p70S6K及Akt/GSK3信号通路的影响目的用rh GLP-1(7-36)联合他克莫司(tacrolimus,Tac)处理人肝HL7702细胞系,观察其对肝细胞Akt/m TOR/p70S6K及Akt/GSK3信号通路的影响。方法培养人HL7702细胞系至对数生长期,分为空白对照组和实验组。实验组分为Tac组、GLP-1组、GLP-1+Tac组,分别用含他克莫司5mg/L、rh GLP-1(7-36)100n M、rh GLP-1(7-36)100n M+他克莫司5mg/L的培养基培养90min,空白对照组用不含他克莫司及rh GLP-1(7-36)的培养基培养90min,观察各组Akt、糖原合成酶激酶3(Glycogen synthase Kinase,GSK3)、糖原合酶(Glycogen synthase,GS)、p70S6K蛋白的磷酸化水平及总蛋白水平,上述蛋白表达水平均用蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测。结果1、与空白对照组比,各实验组中Akt蛋白表达水平及p-Akt(Ser473)蛋白表达水平无明显变化,而p-Akt(Thr308)蛋白表达水平明显增加(Tac组P=0.03、GLP-1组P=0.01、GLP-1+Tac组P=0.004)。与Tac组相比,GLP-1+Tac组中Akt蛋白表达水平及磷酸化水平无明显变化。与GLP-1组相比,GLP-1+Tac组Akt蛋白表达水平及磷酸化水平无明显变化。2、与空白对照组比,各实验组中p70S6K蛋白表达水平无明显变化,而p-p70S6K(Thr389)蛋白表达水平明显增加(Tac组P=0.03、GLP-1组P=0.02、GLP-1+Tac组P=0.047)。与Tac组相比,GLP-1+Tac组中p70S6K蛋白表达水平及磷酸化水平无明显变化。与GLP-1组相比,GLP-1+Tac组中p70S6K蛋白表达水平及磷酸化水平无明显变化。3、与空白对照组比,各实验组中GSK3α及GSK3β蛋白表达水平无明显变化;与空白对照组比,p-GSK3α(Ser21)蛋白表达水平在Tac组中明显降低(P=0.02),在GLP-1组及GLP-1+Tac组中明显升高(P值分别为0.003和0.01);与空白对照组比,p-GSK3β(Ser9)蛋白表达水平在Tac组中明显降低(P=0.02),在GLP-1组及GLP-1+Tac组中明显升高(P值分别为0.002和0.001)。与Tac组相比,GLP-1+Tac组GSK3α和GSK3β蛋白表达水平无明显变化;而p-GSK3α(Ser21)及p-GSK3β(Ser9)蛋白表达水平明显升高(P值均<0.001)。与GLP-1组相比,GLP-1+Tac组中GSK3和p-GSK3蛋白表达水平均无明显变化。4、与空白对照组比,各实验组中GS蛋白表达水平无明显变化,而p-GS(Ser641)蛋白表达水平在Tac组中明显升高(P=0.048),在GLP-1组及GLP-1+Tac组中均降低(P值均为0.03)。与Tac组相比,GLP-1+Tac组中GS蛋白表达水平无明显变化,而p-GS(Ser641)蛋白表达水平明显降低(P=0.001)。与GLP-1组相比,GLP-1+Tac组中GS及p-GS(Ser641)蛋白表达水平均无明显变化。结论在本实验条件下:1、他克莫司可激活Akt/m TOR/p70S6K信号通路,可能通过激活该通路促进脂肪合成;他克莫司可激活GSK3/GS信号通路,可能通过激活该通路抑制GS活性,抑制糖原合成。2、GLP-1可抑制GSK3/GS信号通路,可能通过抑制该通路激活GS活性,促进糖原合成。3、GLP-1可抑制他克莫司对GSK3/GS信号通路的激活作用,推测进而激活GS活性,促进糖原合成。该研究为GLP-1类降糖药治疗他克莫司导致的血糖升高提供了一定的实验依据。