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目的:一方面,通过两种生物信息学方法比较分析,筛选二至丸延缓衰老的活性成分,预测其活性成分的作用靶点,构建相应分子网络,提高预测分析的准确率为后续实验提供研究方向;另一方面,通过生物实验方法,验证二至丸延缓衰老的药效及预测分子机制,为后续滋阴方延缓衰老的实验和临床研究提供参考。方法:1基于网络药理学二至丸延缓衰老分子机制研究首先通过《中医药数据库》、《中医药大辞典》、Pub Chem数据库、TCMSP数据库收集二至丸所有化学成分,并以ADME作为进一步筛选活性化合物的标准,然后通过Swiss Target Prediction数据库进行靶标垂钓,预测二至丸人类活性靶蛋白基因名称。其次,通过Gene数据库构建衰老人类相关基因,并与上述化合物的靶点进行匹配,进一步获得二至丸与衰老相关的靶点。再次,运用IPA数据库构建上述两者的分子网络并分析它们共同作用的生物学通路及可能的作用位点。运用Cytoscape软件构建化合物-靶点网络,并进行Clue GO分析和KEGG通路整合。最后,比较分析IPA和DAVID所得数据,交叉筛选出两者中共同覆盖的生物学通路与活性靶点,预测二至丸延缓衰老的分子机制,为后续实验提供研究方向。2二至丸对自然衰老模型大鼠的药效学评价模型组(24月龄、雌雄各半)、青年对照组(6月龄、雄性)、二至丸组(24月龄、雌雄各半),每组6只,模型组与青年对照组饲食正常标准饲料30g/只/天,二至丸组饲食含有9%二至丸的混合饲料30g/只/天,持续给药90天。末次给药24小时后,用乙醚混合10%水合氯醛联合麻醉,按照0.3ml/100g 10%水合氯醛腹腔注射麻醉并对大鼠进行腹主动脉采血。全自动动物血细胞分析仪进行血常规指标(16项)检测;按照南京建成试剂盒说明书操作,测定血清中5个指标(T-CHO、TG、LPO、SOD、MDA)含量。3二至丸延缓衰老的分子机制验证采取免疫印迹法检测大鼠肾脏组织中HIF1α、NF-κB、PPARγ、TNFα蛋白的表达。结果:1基于网络药理学二至丸延缓衰老分子机制研究(1)Ingenuity Pathway Analysis(IPA)截至2019年7月31日,通过Gene和Pubchem数据库筛选出衰老相关基因909个,二至丸靶蛋白335个。经IPA软件筛选后得到衰老基因匹配908个,二至丸靶蛋白匹配322个。通过Core Analysis分析,二至丸靶蛋白构建分子网络7个,评分最高141分;衰老相关基因构建分子网络13个,评分最高139分。运行Comparison Analysis模块,对比分析二至丸靶蛋白和衰老相关基因作用的生物学通路发现,二者共同作用的通路有412条,其中排名靠前的有神经炎症信号通路、肝纤维化/肝星状细胞活化、白细胞介素-12在巨噬细胞中的信号传导和产生、P13K/AKT信号通路、过氧化物酶体增殖物激活受体信号等,主要涉及凋亡、肿瘤、抗炎、脂代谢、心血管、氧化应激等相关生物学通路。二至丸靶蛋白及衰老相关基因共同交联的药物靶分子有肿瘤蛋白p53(TP53)、核转录因子(NF-κB)、肿瘤坏死因子-α(TNFα)、迁移和缺氧诱导因子-1α(HIF1α)等4048个。其中1768个生物标记物应用于疾病的诊断、功效、安全性的评估。(2)The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery(DAVID)截至2019年7月26日,通过Pubchem和Uniprot数据库筛选出二至丸靶蛋白基因344个,将其与衰老相关人类基因进行重复筛选,得到两者共同交联基因100个。结合String数据库,得到二至丸延缓衰老的可能靶点98个,其中包括103个节点,763条边。将String数据库得到的文件导入Cytoscape软件,选取在“度中心性”,“中介中心性”,“接近中心性”3个参数上均大于中位数的点作为核心靶点,进行筛选之后得到TNF、PPARG、HIF1α等22个相应的核心靶点。通过运用DAVID对98个靶点进行富集分析,以P<0.01为筛选标准,获得GO生物学富集过程268个,经KEGG分析得到89个相关通路。在对生物学富集过程的分析中发现,二至丸延缓衰老的作用靶点涉及诸多不同的生物学类型,前10个条目主要涉及细胞凋亡、肿瘤、炎症反应、心血管等方面;通过对98个靶点进行KEGG通路富集分析,依据P<0.01筛选出前10位的相关通路,其中包括:hsa04066:HIF-1信号通路,hsa05200:肿瘤信号通路,hsa04668:TNF信号通路,hsa04210:细胞凋亡信号通路,hsa04151:PI3K-Akt信号通路等。(3)IPA与DAVID数据的对比分析通过对IPA与DAVID数据进行交叉分析,我们发现两者共同覆盖的核心作用靶点主要为TNF、HIF1A、NF-κB及PPARG;信号通路主要为TNF信号通路、NF-κB信号通路、PPAR信号通路、HIF1信号通路、细胞凋亡信号通路、肿瘤信号通路等,涉及凋亡、肿瘤、抗炎、脂代谢、心血管等相关生物学通路。2二至丸对自然衰老模型大鼠药效学评价(1)与模型组比较,二至丸组淋巴细胞计数比值、平均血小板体积显著升高(P<0.05),单核细胞计数比值、血红蛋白含量,血细胞比容、血小板计数显著降低(P<0.05)(2)与模型组比较,二至丸组脂质过氧化物含量显著降低(P<0.05)。3二至丸延缓衰老的分子机制验证(1)与模型组比较,二至丸组肾脏组织中的NF-κB表达量显著降低(P<0.05),PPARγ表达量显著升高(P<0.05)。结论:1二至丸可能通过干预衰老相关的TNF、NF-κB、HIF1、PPAR通路中多个位点发挥其延缓衰老的作用。2二至丸可能抑制单核细胞活化;缓解老年大鼠血液粘度状况;可以抑制自然衰老大鼠血液中血小板聚集,改善血液流变学状态,防止血管内血栓生成。3二至丸可能通过调节衰老大鼠脂代谢能力;可能提高衰老大鼠细胞抗氧化应激能力来改善衰老大鼠细胞损伤程度。4二至丸可能通过上调PPARγ表达量来抑制NF-κB的表达,并与HIF1α、TNFα共同作用来减轻炎症因子过表达,调节老年大鼠炎症反应,缓解老年大鼠血液粘度状况,改善老年大鼠免疫状态,共同起到延缓衰老的作用。