论文部分内容阅读
目的:评价新型CA-4类化合物MZ3对白血病体内与体外的抑制作用,研究MZ3的抗白血病作用机制。方法:采用MTT法评价MZ3体外抑制六种人白血病细胞（NB4,Molt-4,HL60,K562和耐药细胞株HL60R,K562R）的活性,测定MZ3对这六株细胞的IC50值;采用荷HL60人白血病细胞的SCID小鼠模型评价MZ3体内抗白血病活性,绘制小鼠的存活曲线,计算中位生存时间（mediam survival time,MST）。采用DAPI染色观察MZ3诱导K562产生的凋亡小体;采用DNA电泳检测MZ3诱导HL60和K562细胞产生的DNA梯状电泳;采用PI染色结合流式细胞术检测MZ3诱导HL60和K562细胞凋亡的作用。采用JC1染色结合流式细胞术检测MZ3对HL60细胞线粒体膜电位（mitochondrial membranepotential,ΔΨm）的影响;采用Carboxy-DCFDA染色检测MZ3对HL60细胞活性氧族（reactive oxygen species,ROS）含量的影响;采用PI染色结合流式细胞术检测MZ3对K562细胞周期分布的影响;采用免疫荧光法观察MZ3对K562细胞内微管蛋白的影响;采用Western blotting检测MZ3对HL60和K562细胞中凋亡相关蛋白（caspase-3,PARP）的影响,MZ3对HL60细胞中线粒体相关蛋白（ERK1/2,P38,JNK,p-ERK1/2,p-P38,p-JNK,Bax,Bcl-2）的影响,MZ3对K562细胞中周期相关蛋白（cyclin B1,cdc2,cdc25C,Wee1,CDK7,MPM-2）和微管蛋白的影响。结果:1.MZ3对所选的六株白血病细胞均有较好的抑制作用,IC50值均小于8.0μM,对白血病耐药株也呈现较好的抑制活性,对NB4,Molt-4,HL60和K562的IC50值分别为1.2±0.2μM,4.2±0.4μM,2.7±0.2μM,3.4±0.1μM,对白血病耐药株HL60R和K562R细胞的IC50分别为3.5±0.5μM和8.0±0.3μM。2.在荷HL60人白血病细胞的SCID小鼠实验中,对照组6只小鼠在接种HL60细胞后20天内全部死亡,中位生存时间（MST）为15天;而环磷酰胺阳性对照组和MZ3给药组第一只小鼠死亡分别发生在第25和第26天,MST分别为26.5天和33.5天。环磷酰胺（10.0mg/kg）和MZ3（10.0mg/kg）均可以延长白血病SCID小鼠的生存时间,且MZ3效果优于环磷酰胺。3.DAPI染色显示,16.0μM MZ3作用K562细胞24 h后可使细胞产生凋亡小体。DNA电泳结果显示,4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3作用HL60细胞24 h均可使细胞产生凋亡特征性的DNA梯状条带;8.0μM和16.0μM MZ3作用K562细胞24 h可使细胞产生凋亡特征性的DNA梯状条带。4.流式细胞术结果表明,8.0μM MZ3作用HL60细胞0 h,6 h,12 h,24h,48h和72h均能诱导HL60细胞发生凋亡,其凋亡率分别为0.9%,2.5%,14.2%,30.5%,65.5%和85.4%,呈时间依赖性关系;16.0μM MZ3作用K562细胞0 h,6 h,12 h和24 h均能诱导K562细胞发生凋亡,其凋亡率分别为2.5%,2.8%,5.8%和31.3%,呈时间依赖性关系;0.0μM,4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3作用K562细胞24 h能够诱导K562细胞发生凋亡,其凋亡率分别为4.4%,35.0%,36.6%和31.3%K562细胞发生凋亡。5.Western blotting结果显示,8.0μM MZ3作用HL60细胞12 h和24 h可使细胞内procaspase-3被切割激活,进而水解其底物PARP,最终诱导细胞凋亡;4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3作用K562细胞24 h可使细胞内procaspase-3被切割激活,进而水解其底物PARP,最终诱导细胞凋亡。6.JC1染色法检测细胞线粒体膜电位（ΔΨm）结果显示,8.0μM MZ3作用HL60细胞0 h,8 h,16 h和24 h可分别可使2.0%,3.0%,18.9%和48.4%HL60细胞呈现绿色荧光,即ΔΨm降低,呈时间依赖性关系。7.Carboxy-DCFDA染色法检测细胞ROS含量结果显示,8.0μM MZ3作用HL60细胞0 h,1 h,2 h,3 h和4 h后细胞绿色荧光强度分别为22.9,26.5,38.3,32.4和29.5;细胞内ROS含量在2 h点升到最高,为0 h点的1.7倍,随后ROS含量回到给药前水平。8.1.0μM,2.0μM,4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3与或不与ROS抑制剂NAC（200.0μM）同时作用HL60细胞72h后分别可抑制8.8±11.0%,59.0±8.7%,81.7±9.1%,87.1±4.2%,87.9±3.6%和17.1±5.2%,57.8±9.1%,82.2±5.2%,86.7±2.8%,87.6±2.1%细胞的生长。说明NAC不能抑制MZ3的细胞毒作用。9.Western blotting结果显示,8.0μM MZ3作用HL60细胞6 h,12 h和24 h还可使细胞内Bax呈时间依赖性递增,Bcl-2呈时间依赖性递减,Bax/Bcl-2的比例分别为2.2,15.7和28.5。8.0μM MZ3作用HL60细胞6h,12h和24h可使细胞内P-ERK1/2显著递减,减弱ERK1/2的活性,P-p38和P-JNK显著递增,增强p38和JNK的活性。说明MZ3可通过影响HL60细胞中MAPK家族和Bcl-2家族蛋白的表达和活化,激活线粒凋亡通路,最终导致细胞凋亡。10.流式细胞术结果表明,16.0μM MZ3作用K562细胞0h,6h,12h,24h分别能够使6.1%,11.1%,31.1%和38.1%K562细胞阻滞于G2/M期,呈时间依赖性关系;0.0μM,4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3作用K562细胞24h分别能够使10.8%,25.7%,28.2%和38.1%K562细胞阻滞于G2/M期呈剂量依赖性关系。11.免疫荧光结果显示,16.0μM MZ3作用K562细胞24h使得许多细胞内微管数量明显减少。分离细胞内可溶性的微管蛋白（即未聚合的微管蛋白）分离后,通过western blotting检测,结果显示1.0μM,2.0μM,4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3作用K562细胞24h后,细胞内的可溶性微管蛋白含量呈剂量依赖性增加,暗示着细胞内聚集状态的微管蛋白有所减少。说明MZ3也可通过影响K562细胞中微管蛋白的聚合,导致K562细胞阻滞于G2/M。12.Western blotting结果显示,4.0μM,8.0μM和16.0μM MZ3作用K562细胞24h后使得细胞内cyclin B1和MPM-2水平升高,cdc2c和dc25C水平降低,Wee1活性增加。说明MZ3可通过影响K562细胞中周期调节蛋白,导致K562细胞阻滞于G2/M。结论:MZ3在体内和体外均有较好的抗白血病作用,且能够对抗多药耐药细胞,为一非常有前景的抗白血病药物。MZ3能够诱导HL60和K562细胞产生凋亡,其机制可能是:1)影响MAPK家族和Bcl-2家族蛋白的表达和活化,激活线粒体凋亡通路;2)影响周期调节蛋白和细胞内微管蛋白的聚合,使细胞阻滞于G2/M期。