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研究背景和目的：胃癌是我国最常见的消化道肿瘤,占恶性肿瘤死亡率的第一位,已严重影响到我国人民的生命健康,目前早期胃癌术后五年生存率可达95%,而晚期胃癌总体疗效不理想,约50%在5年内死亡。大部分胃癌患者确诊时已是晚期,不能进行手术根治,因此胃癌化学治疗(以下简称化疗)已引起越来越多的医学工作者的重视,虽然据大量的研究证实化疗可以为晚期胃癌患者带来生存益处,但化疗常有严重的不良反应以及患者对化疗药物的耐药,从而严重限制了化疗的使用。因此研究肿瘤化疗耐药就成为亟待解决的问题。阿霉素(doxorubicin)为蒽环类的抗肿瘤药,应用非常广泛,是1960年从链霉菌属中分离出来的,它杀死肿瘤细胞的主要机制之一是通过干扰拓扑异构酶Ⅱ,当拓扑异构酶Ⅱ解聚分裂DNA,阿霉素就与其中的分裂产物结合,抑制分裂产物再形成双链结构,而导致双链DNA的断裂。PTEN (phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten),又称为MMAC1或TEP1,是1997年由三个独立的研究组首次发现的。PTEN定位于染色体10,该区域在肿瘤中存在很频繁的体细胞突变。PTEN基因有9个外显子,8个内含子,编码403个氨基酸,有双重的磷酸酶活性(脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶)。PTEN的缺失／突变存在于一系列的人类肿瘤中,包括大脑、乳腺、前列腺、子宫内膜和卵巢等。近来也有研究表明PTEN能够增强某些化疗药物对肿瘤细胞的敏感性。PTEN的基因治疗被发现是一种能够逆转肿瘤细胞耐药性的有效方法。作为一个多功能的磷酸酶,PTEN蛋白可通过多条信号传导通路来参与调控细胞增殖、凋亡、运动、侵袭、细胞体积以及干细胞的自我更新等多种生物学行为。其中,PTEN最主要的功能是通过其脂质磷酸酶(lipid phosphotase)活性调控磷脂酰肌醇3-激酶／蛋白激酶B(Phosphoinositide 3-kinase/AKT, PI3K/AKT)通路活性。P13K被激活后,介导磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)磷酸化成为重要的第二信使磷脂酰肌醇—3,4,5—三磷酸(PIP3)。PIP3可激活磷脂酰肌醇依赖性激酶1(Phosphoinositide/dependent kinase, PDK1)转导。PIP3还能直接与AKT蛋白的N端PH区高特异性地结合成二聚体,增强其被磷酸化的能力。PTEN蛋白的高度保守磷酸酶区包含两个独特的赖氨酸残基,能特异性去除磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸肌醇环D3位磷酸根并负向调控PIP3,从而抑制PI3K/AKT及其下游通路,促使细胞周期停滞并诱导细胞凋亡。故本次课题旨于研究1)化疗药物干预胃癌细胞后,PTEN的mRNA和蛋白表达水平以及可能的机制2)体外实验中稳定转染PTEN能否提高胃癌的化疗敏感性3)体外实验中降低PTEN的表达能否抑制胃癌的化疗敏感性4)体内试验进一步证实PTEN能否提高化疗药物的敏感性。方法：1)人胃腺癌细胞株BGC-823用含10%胎牛血清RPMI-1640培养基按贴壁方法在37℃含5%CO2孵箱内培养；2)用阿霉素(Doxorubicin, DOX)干预,分别用MTT法和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素-碘化丙啶(Annexin V-FITC-PI)凋亡检测试剂盒检测胃癌细胞株存活率、凋亡率,RT-PCR和Western Blotting法检测PTEN和Notch1 mRNA以及蛋白表达水平；3)Notch1 siRNA转染胃癌细胞株BGC-823,用阿霉素干预,检测PTEN和Notchl蛋白表达水平；4)pEAK8-PTEN质粒转染胃癌细胞,阿霉素干预,检测胃癌细胞株的存活率和凋亡率以及PTEN和p-AKT的表达情况；5)PTEN siRNA转染胃癌细胞株,阿霉素干预,检测胃癌细胞株的存活率和凋亡率以及PTEN的表达；6)裸小鼠皮下种植pEAK8-PTEN-BGC-823细胞株,构建胃癌的异位种植瘤模型,检测移植瘤瘤体积以及瘤体重量的大小,用TUNEL试剂盒检测瘤体组织凋亡率的变化。结果：1)阿霉素干预胃癌细胞后3、6、12 h,细胞存活率分别为(84.93±2.05)%、(75.35±2.11)%和(44.94±2.62)%,呈时间依赖性降低,与对照组Oh[(98.24±0.60)%]比较差异有统计学意义(P<0.05)；阿霉素干预12 h后,细胞凋亡率为(31.37±3.58)%,明显高于对照组的(2.59±0.92)%,P<0.05。2)阿霉素处理BGC-823细胞后,PTEN、Notchl的mRNA和蛋白表达均随着时间的延长逐渐增高,差异有统计学意义(P<0.05)；3)当运用Notch1 siRNA转染胃癌细胞后,Notch1表达水平下降,当转染后给予阿霉素进行干预,Notch1的表达随之上升,PTEN有相同的变化趋势；4)BGC-823稳定转染pEAK8-PTEN质粒,PTEN mRNA和蛋白在pEAK8-BGC-823和BGC-823中表达很弱,差异无统计学意义(P>0.05),而在pEAK8-PTEN-BGC-823中表达明显高于pEAK8-BGC-823和BGC823,差异有统计学意义(P<0.05)；5)0.3 umol／L阿霉素干预3种细胞12h,pEAK8-PTEN-BGC-823细胞存活率为(22.45±1.05)%；BGC823为(40.57±1.21)%, pEAK8-BGC-823为(37.61±0.22)%,阿霉素对pEAK8-PTEN-BGC-823抑制率要明显高于pEAK8-BGC-823和BGC823,差异有统计学意义(P<0.05)；pEAK8-BGC-823和BGC823两者之间差异无统计学意义(P>0.05)；流式双染法检测阿霉素(0.3umol／L)干预12h后,pEAK8-PTEN-BGC-823凋亡率达到(45.2±4.5)%,与pEAK8-BGC-823和BGC823之间差异有统计学意义[(28.9±3.2)%和(27.8±2.6)%,P<0.05]；6)稳定转染PTEN后,PTEN的表达明显增加,p-AKT的表达比pEAK8组则要下降,差异有统计学意义,当给予阿霉素干预后,PTEN的表达明显增加,高于阿霉素干预pEAK8组的表达,而p-AKT的表达则与PTEN相反,差异有统计学意义；7)PTEN siRNA转染组给予阿霉素干预后的存活率为(76.52±3.24)%,对照组给予阿霉素干预后的存活率为(43.52±4.69)%,差异有统计学意义(P<0.05)；PTEN siRNA转染组给予阿霉素干预后的凋亡率为(10.35±1.04)%,对照组给予阿霉素干预后的凋亡率为(31.37±3.58)%,差异有统计学意义(P<0.05)；8)体内试验证实稳定转染PTEN质粒组可提高阿霉素对裸鼠移植瘤的抗肿瘤疗效,并可提高瘤体组织内的凋亡率。结论：化疗药物阿霉素明显促进胃癌细胞BGC-823的凋亡及生长抑制,且PTENmRNA和蛋白的表达上调；阿霉素干预胃癌细胞后PTEN的表达上调的原因可能是因为Notch1被激活所致；胃腺癌细胞株BGC-823稳定转染PTEN可增加对化疗药物的敏感性,运用PTEN siRNA敲低PTEN的表达后可降低胃癌细胞株对化疗药物的敏感性,为基因治疗和化学药物的联合治疗提供了理论依据。