小檗碱(berberine,BBR)俗称黄连素,是一种从植物中提取得到的小分子天然化合物,因其来源广泛、廉价安全,具有工业应用的价值。核酸适配体(Aptamer)通常指一段RNA、DNA或核酸类似物的片段,能与目标物高特异性、高亲和性地结合。RNA适配体可形成多样化的二级结构,同时RNA片段在微生物体内可通过转录过程得到,因此可被用于设计构建遗传调控元件。而DNA适配体的稳定性更强,不受广泛存在的RNase影响,更有利于在体外环境下与小分子配体相互作用,因此可被应用于分子诊断、核酸探针、生物芯片及生物传感器等领域。本研究通过SELEX技术筛选得到能与BBR高亲和性结合的特异性RNA及DNA片段。以RNA适配体为基础构建受BBR诱导的遗传开关元件,通过配体BBR和能与BBR特异性结合的适配体序列之间的相互作用实现对基因表达的调控,将BBR开发为新型诱导剂,有望替代现有的昂贵诱导剂,降低工业生产成本,拓展了 BBR在微生物工业生产中的应用。另外,本文尝试构建一种基于AuNPs 比色法的BBR生物传感器,用于简便、快速、低成本的检测BBR,为今后生物传感器的开发及BBR在其他领域的应用提供基础。主要研究内容如下:1.以BBR为靶分子,通过16轮的SELEX循环,从随机文库中筛选出能与BBR特异性结合且亲和力较大的RNA适配体片段R1:5,-CAUCAUUGCCUAGUCUGAUCUCAUCUCCGUCAGAUUGAUG-3’,用mfold软件对适配体R1进行了二级结构模拟,显示其易于形成茎环结构。之后运用平衡渗透法测得适配体R1与BBR的解离常数Kd=764±15 nM,R1与BBR的亲和力较高,可以满足遗传元件构建的要求。2.利用筛选得到的BBR核糖核酸适配体R1,设计构建了一种受BBR诱导的核糖开关元件,以此调控基因表达,对得到的重组菌E.coli(pTAC1SA-Aptamer-N10RBS-egfp)进行发酵,通过控制添加或不添加BBR,测定重组菌受BBR诱导的EGFP表达情况,通过对比28株重组菌株与野生型E.coli BL21和E.coli(Ptac-egfp)在发酵过程中的荧光强度变化情况,得出重组菌C25中的核糖开关元件功能较好,其关闭效率为97%,打开效率为77%,ON/OFF 比率达到8.94,可以很好地受BBR诱导调控下游基因表达,有进一步开发应用的价值。3.以BBR为靶物质,利用SELEX技术进行了 8轮的筛选,得到能与之高特异性、高亲和力结合的DNA适配体片段。对其中8条重复率较高的适配体进行一级结构分析及二级结构模拟,发现适配体序列富含GC,且易形成茎环及G-四链体结构。采用平衡渗透法对8条适配体与BBR作用的亲和力进行了测定,结果表明适配体S23的Kd值最小,仅为414nM,与BBR亲和力最大,为开发BBR介导的生物传感器奠定基础。4.建立了 Aptamer-AuNPs介导的比色传感器,用于简便、快速、低成本的检测BBR。分别探究了 NaCl浓度、适配体浓度、适配体与AuNPs的结合时间及结合温度对反应体系中AuNPs聚沉现象的影响,确定了最佳NaCl浓度为0.4 mol/L,最佳适配体浓度为500 nM,最佳结合时间为1 h,最佳反应温度为35℃。在体系中添加不同浓度的BBR以考察适配体-AuNPs体系对BBR的响应敏感性,结果表明加入BBR后,体系的吸光值明显下降,Aptamer-AuNPs 比色传感器可以很好地检测到样品中存在的BBR。然而吸光值与BBR浓度变化的相关性不高,二者拟合曲线为y=-1.06×10-4x+0.1263,R2为0.776,其检测灵敏性有待提高。