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酶催化生物体内的化学反应,是生命代谢运转的动力。生物催化为核心的工业生物技术成为现代生物技术发展的第三次浪潮。酶催化的高效性是行业应用的限制瓶颈,通过设计改造形成高效的工业化酶是工业生物技术需要攻克的关键问题。酶的催化效率受稳定性和底物专一性的影响。底物的非专一性又叫混杂性(promiscuity),本质上是指一种酶能够催化多种不同的底物。糖苷水解酶(Glycosidehydrolase,GH)是应用非常广泛的工业化酶制剂,但这类酶底物专一性不强,具有很高的混杂性,影响了催化效率或产物得率等。因此,通过理性设计的方法降低其混杂性、提高产物的专一性是十分必要的。本研究利用结构生物信息学方法和分子动力学模拟对GH11、GH12、GH29家族中酶分子的功能混杂性机制进行研究,并通过计算机辅助筛选和湿实验相结合的方法,对GH29家族酶分子BfNCTC9343进行改造,成功降低了该酶分子的功能混杂性。本论文开展的相关研究工作及主要成果如下:(1)对拓扑结构相似,混杂性不同的GH11和GH12家族的糖苷水解进行分子动力学模拟实验,结果发现,活性架构的分子动态是造成2个家族间的酶分子功能混杂性产生差异的重要因素。GH12家族活性架构氨基酸的构象分布多样且分散,有利于酶分子结合不同种类的底物。(2)对GH11和GH12家族酶分子活性架构亚位点上氨基酸的构象进行表征和分类,结果发现,GH12家族活性架构具有数量较多的构象多样型氨基酸残基,并且这些构象多样的氨基酸残基遍布整个活性架构,有利于酶分子结合不同种类的底物。(3)对GH12家族内混杂性的TrCel12A和底物专一性的HsCe112A这2个酶分子的骨架柔性进行分析,结果发现,TrCel12A中Loop3具有明显的高柔性,并且GH12家族中其他能催化复杂底物的酶分子均具有这一特点。结合能计算和分子对接实验进一步表明,在酶分子与复杂底物的结合过程中,TrCel12A的Loop3具有高柔性这一特点,能够降低酶分子与复杂底物的取代基之间形成空间位阻的概率,使酶分子能够结合复杂底物,因此酶分子具有功能混杂性。(4)对GH29家族岩藻糖苷酶BfNCTC9343在不同温度条件下进行分子动力学模拟,分析发现,温度升高导致关键Loop4结构的柔性发生变化,影响了活性架构的分子动态。Loop4上关键氨基酸229D和288E之间的距离增大,增加了底物分子构象转变的概率,导致酶分子的功能混杂性发生改变。(5)通过利用计算机模辅助筛选找到L224H突变体,可以明显降低该酶的混杂性。实验结果同时说明,酶分子活性架构和关键Loop的分子动态确实对其功能的混杂性具有非常重要的影响。