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特定mRNA的输出、转录和翻译是基因表达的必要前提。然而,这些连续步骤之间的功能联系尚不清楚。在酵母及人细胞中,mRNA输出因子Glel对mRNA从细胞核到细胞质的输出是必需的,有研究显示Glel参与酿酒酵母的蛋白质翻译起始和翻译终止,并且在翻译终止中Glel可以直接与肽链释放因子相互作用。在真核生物中,两类肽链释放因子参与蛋白质的翻译终止,分别是第一类肽链释放因子eRF1和第二类肽链释放因子eRF3。人类细胞中存在两种eRF3,分别为heRF3a、heRF3b,二者只有N末端结构域不同。为了了解Glel是否也参与了人的蛋白质翻译终止,本研究利用酵母双杂交以及免疫共沉淀证实了人Glel蛋白与参与蛋白质合成终止的两类肽链释放因子之间的相互作用,并初步确定了hGlel与肽链释放因子相互作用的区域。同时通过免疫共定位分析了在HeLa细胞中hGlel蛋白与两类肽链释放因子的亚细胞共定位。此外,本研究检测了hGlel的过表达对蛋白质合成、蛋白质翻译终止以及细胞增殖的影响。研究的主要结果如下：利用本实验室已构建的重组质粒pBluescript-hGle1和已克隆的人类heRFl、heRF3a以及heRF3b构建了一系列酵母双杂交重组质粒,并将这些重组质粒分别共转化至酵母菌株AH109,同时设定实验对照组,经四缺培养基SD-Leu-Trp-His-Ade严格筛选,β-半乳糖苷酶活性分析结果表明,表达hGle1/heRF1, hGle1/heRF3a或者hGlel/heRF3b的酵母菌均显示蓝色,与阳性对照组(表达heRF1/heRF3a)的结果一致,而阴性对照组(只表达hGlel, heRF1, heRF3a或heRF3b)则未显示蓝色。表明hGlel与人两类肽链释放因子heRFl, heRF3a, heRF3b均相互作用。为了进一步验证hGlel与肽链释放因子之间的相互作用,构建了真核重组表达质粒pCMV-Myc-heRF1、pCMV-Tag2B-hGle1。采用免疫共沉淀的方法,在HeLa细胞中分别共转染hGlel和两类肽链释放因子的真核表达质粒,并设定对照组。实验结果表明,Flag-hGle1可以免疫共沉淀Myc-heRF1、GFP-heRF3a以及GFP-heRF3b,而在阴性对照的细胞中无法检测出这种相互作用,证实在人细胞中hGlel与两类肽链释放因子之间的相互作用确实存在。为了了解hGle1和两类肽链释放因子在细胞内的分布,构建了重组表达载体pEGFP-N1-heRF1,将质粒pCMV-Tag2B-hGlel和pEGFP-N1-heRF1pEGFP-N1-heRF3a或pEGFP-N1-heRF3b共转染HeLa细胞。用hGlel的特异性抗体免疫染色,激光共聚焦显微镜观察发现,融合有绿色荧光蛋白的heRF1、heRF3a和heRF3b大都分布在细胞质,而红色荧光信号所显示的hGlel尽管在核周有大量积累,但在细胞质中仍有分布,提示其在细胞质内可能具有一定的功能。而hGlel与肽链释放因子在细胞质中的共定位也进一步提示hGle1艮可能在调节蛋白质翻译终止的过程中起作用。为了探讨hGle1在蛋白质合成过程中的作用,在HeLa细胞中共转入0.3μg海肾荧光素酶报告基因质粒pRL-TK和0.1μg-0.6μg pCMV-Tag2B-hGlel或pCMV-Tag2B-GST质粒,转染48h后裂解细胞测定海肾荧光素酶的活性。结果表明,与共转入pCMV-Tag2B-GST相比,共转入pCMV-Tag2B-hGlel后细胞内的海肾荧光素酶活性明显升高,并呈现剂量依赖关系,提示在HeLa细胞中hGle1的过表达对细胞内蛋白质的合成有促进作用。进一步采用双荧光素酶报告系统检测hGle1过表达对蛋白质翻译终止的影响,结果显示,共转入pCMV-Tag2B-hGle1后,HeLa细胞内双荧光素酶通读率明显降低,也呈现剂量依赖关系,说明hGlel的过表达促进细胞内蛋白质的翻译终止。利用MTT法检测hGle1的过表达对HeLa细胞增殖率的影响,结果显示,与对照组相比,转入pCMV-Tag2B-hGle1的细胞增殖速率较高,这表明hGle1的过表达对细胞的增殖有一定的促进作用。本研究还初步确定了hGle1和两类肽链释放因子相互作用的结构域。对hGle1进行了截短突变,并构建了3个hGle1截短体酵母双杂交重组质粒：pGADT7-hGle1Δ1-372、pGADT7-hGle1Δ371-659和pGADT7-hGle1Δ477-698.酵母双杂交结果表明hGle1的1-372位氨基酸是其与肽链释放因子相互作用必需的结构域。