论文部分内容阅读
前列腺癌是男性生殖系统的高发肿瘤。雄激素不仅在维持前列腺的正常生长和功能方面起到非常重要的作用,而且在前列腺癌的发生发展中也起到同样重要的作用。药物或者手术去势等雄激素剥脱治疗(Androgen deprivation therapy,ADT)至今仍是早期转移性前列腺癌的标准治疗方法,但是ADT只能缓解不可以根治,大部分患者在去雄治疗后经过短暂的有效期,逐步发展成激素非依赖性前列腺癌。外泌体是任何活细胞均可释放的直径在30~150 nm间包含脂质,蛋白质,核酸如信使RNA(Messenger RNA,mRNA)和小RNA(MicroRNA,miRNA)等多种成分的脂质双层膜结构的细胞外囊泡,这些囊泡内容物反映了分泌细胞的来源与特性,同时也可以作为细胞间信号转导的重要调控剂。目前外泌体miRNAs已被多篇文献报道在前列腺癌的发生、发展过程中有异常表达。故本研究拟对激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP及由LNCaP细胞诱导产生的激素非依赖性前列腺癌细胞LNCaP-AI+F两组细胞间外泌体miRNAs进行差异表达研究,并进一步探讨外泌体miRNAs在前列腺癌细胞激素非依赖转化中的作用,为进一步研究激素非依赖前列腺癌的发生及发展奠定基础。第一部分:外泌体在前列腺癌细胞激素非依赖转化中的作用目的:探讨外泌体在前列腺癌细胞激素非依赖转化中的作用,为研究激素非依赖前列腺癌的发生及发展奠定基础。方法:首先采用超速离心的方法分别从LNCaP细胞及LNCaP-AI+F细胞的无外泌体细胞培养上清中提取外泌体,通过透射电镜和Western blot分别对外泌体形态及其蛋白标志物Alix和CD63进行鉴定。然后将提取的外泌体加入受体细胞,通过细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8,CCK-8)检测外泌体对受体细胞在去雄环境中增殖的影响,流式细胞术检测外泌体对受体细胞在去雄环境中细胞周期的影响,Western blot检测外泌体对受体细胞AR蛋白和p-Akt蛋白表达水平的影响。结果:通过透射电镜观察到外泌体典型的脂质双层膜结构,粒径在30~150 nm,且Western blot结果显示超速离心样本表达外泌体蛋白Alix和CD63。LNCaP-AI+F细胞外泌体可以促进LNCaP细胞在去雄环境中的增殖,增加细胞周期中S期细胞的比例,上调雄激素受体(Androgen receptor,AR)及p-Akt蛋白的表达;相反LNCaP细胞外泌体可以抑制LNCaP-AI+F细胞在去雄环境中的增殖,增加细胞周期中G0-G1期细胞的比例,减少AR蛋白的表达。结论:LNCaP-AI+F细胞外泌体促进LNCaP细胞往激素非依赖方向转化,这可能与AKT信号通路的活化有关。LNCaP细胞外泌体可能会逆转LNCaP-AI+F细胞激素非依赖表型。第二部分:外泌体miRNAs在前列腺癌细胞激素非依赖转化中的差异表达目的:寻找在前列腺癌细胞激素非依赖转化中差异表达的外泌体miRNAs,为进一步研究激素非依赖前列腺癌的发生及发展奠定基础。方法:收集LNCaP细胞和LNCaP-AI+F细胞的无外泌体细胞培养上清,提取外泌体,采用Zetasizer仪和流式细胞术分析外泌体粒径和外泌体标志物CD63、CD81的表达。随后通过高通量测序技术筛选在两组细胞外泌体中差异表达的miRNAs,进一步采用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR)在细胞内及其外泌体中验证差异表达的miRNAs。结果:Zetasizer结果显示外泌体粒径在30~150 nm之间,流式细胞术结果显示外泌体标志物CD63、CD81的表达均为阳性。通过筛选高通量测序结果,发现在两组细胞外泌体中有显著表达差异的miRNAs共214个,其中196个上调,18个下调。从中选取15个差异表达的外泌体miRNAs进行qRT-PCR验证.结论:差异表达外泌体miRNAs可能在激素非依赖前列腺癌的发展过程中发挥重要作用。第三部分:let-7a-5p在前列腺癌细胞激素非依赖转化中的作用目的:进一步探讨let-7a-5p在前列腺癌细胞激素非依赖转化中的作用方法:let-7a-5p mimic和let-7a-5p inhibitor分别转染LNCaP细胞和LNCaP-AI+F细胞,CCK-8检测let-7a-5p表达量的变化是否引起细胞在去雄环境中增殖的变化,流式细胞术检测let-7a-5p表达量的变化是否引起细胞在去雄环境中细胞周期的变化,Western blot检测let-7a-5p表达量的变化对LNCaP细胞AR蛋白和p-Akt蛋白表达水平的影响。结果:let-7a-5p mimic转染LNCaP细胞之后可以促进LNCaP细胞在去雄环境中的增殖,增加细胞周期中S期细胞比例,上调细胞AR蛋白和p-Akt蛋白的表达;相反let-7a-5p inhibitor转染LNCaP-AI+F细胞后可抑制细胞在去雄环境中的增殖,增加细胞周期中G0-G1期细胞比例。结论:let-7a-5p可以促进前列腺癌细胞激素非依赖转化,这可能与AKT信号通路的活化有关。