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伪狂犬病(PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的一种对养猪业危害极大的传染病。2011年下半年,PRV变异株在我国免疫猪群中开始流行。本实验室率先分离到变异株,命名为He N1株。研究表明接种现有疫苗株不能使易感动物获得对变异株的完全保护,血清中和试验显示疫苗株Bartha-K61与HeN1株之间存在明显的抗原差异。gC蛋白是PRV重要的中和性抗原,其变异可能会导致疫苗株免疫猪体后产生的中和抗体不能对PRV变异株进行有效的中和。因此我们利用酵母表面展示技术获取疫苗株Bartha-K61与变异株HeN1 gC蛋白的抗原区,来探究毒株间的抗原性差异。为了解PRV变异株的流行及变异情况,2016~2017年间,对来自安徽、河北、山东等省份的大中型猪场送检的疑似PRV病料进行PCR检测,鉴定出16份PRV阳性病料,对其gC、gE基因进行序列分析,两者氨基酸序列与2012年以来的变异株的相应氨基酸序列同源性分别为98.2%~100%与99.3~100%,与经典株的相应氨基酸序列同源性相对较低,分别为92.5%~94.8%与95.3%~99.1%。变异株的gE蛋白均在第48位和第492位各插入1个天冬氨酸,在gC蛋白的64~70位处连续插入7个氨基酸,分离株具有与变异株相同的分子标记,并且分离的16株PRV与GenBank下载的近年来国内报道的PRV变异毒株在系统进化树上处于同一分支,与经典株位于不同分支,表明HeN1株仍是目前PRV流行毒株的代表毒株。本研究利用DNase I将疫苗株Bartha-K61与变异株He N1的gC基因随机酶切成100~250 bp的小片段,然后连接到酵母展示载体pCTCON2中,将连接产物电转入大肠杆菌DH5α中构建随机的酵母展示文库。提取两个文库的质粒并电转入制备的酿酒酵母EBY-100感受态中进行培养诱导。用抗Bartha-K61与抗HeN1株的猪阳性血清分别对两个诱导表达后的酵母文库进行染色,通过流式细胞仪对阳性酵母进行经两轮分选富集,提取富集后阳性酵母的质粒进行测序分析,通过分析克隆的分布及个数来绘制抗原区图谱。结果显示,HeN1-gC蛋白的主要抗原区位于A1区(23-152位aa)、次要抗原区位于A3区(337-487位aa)、非抗原区位于A2区(153-336位aa);Bartha-K61-gC蛋白的主要抗原区位于B1区(23-130位aa)、次要抗原区位于B2区(131-222位aa)、非抗原区位于B3区(223-480位aa)。将两毒株gC蛋白的各抗原区片段进行酵母展示表达与原核表达,进行流式分析与ELISA分析,结果验证了两毒株gC蛋白的各抗原区的抗原特性,抗原区与血清交叉分析表明两毒株gC蛋白的主抗原区的抗原性差异不大,次要抗原区的抗原性存在差异,非抗原区与血清交叉分析存在一定的抗原性,本研究推测PRV两毒株gC蛋白之间的抗原差异性可能与氨基酸的同源性关系较小,而与病毒自身的调控有关。综上所述,本研究利用酵母展示技术将构建的疫苗株Bartha-K61与变异株HeN1的gC蛋白抗原文库展示于酵母表面,筛选并鉴定了两毒株gC蛋白的主抗原区与次抗原区,以上研究为揭示PRV毒株间的变异及免疫逃避的机制提供基础。