论文部分内容阅读
目的:研究氧化三甲胺与血管紧张素II 1型受体（Angiotensin II type 1 receptor,AT1R）在动脉粥样硬化中的相互作用。方法:1、第一部分:将17只6周龄载脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein E gene knockout,Apoe-/-)小鼠随机分为两组:对照组（n=8）和替米沙坦（Telmisartan,TLM）治疗组（n=9）,均给予高脂喂食,治疗组给予替米沙坦10mg·kg-1·d-1灌胃,饲养12周后麻醉处死,眶窦采血,全自动酶比色法检测血脂、高效液相色谱串联质谱法测定血浆氧化三甲胺（Trimethylamine N-oxide,TMAO）的含量;动脉粥样硬化的程度检测:油红“O”染色确定主动脉根部斑块面积,免疫组化法检测斑块内炎性因子IL-6、MCP-1的表达情况,收集两组小鼠结肠粪便,并采用16S-r RNA测序分析对肠道菌群进行鉴定。2、第二部分:将21只6周龄Apo E-/-小鼠随机分组,每组n=7,分为对照组（control,CTL）、高氧化三甲胺组（High tmao,TMAO）、TMAO+替米沙坦（Telmisartan,TLM）干预组,分别给予普食、1%胆碱、1%胆碱+替米沙坦(10mg·kg-1·d-1灌胃)喂食,饲养12周,规律监测鼠尾血压、测量体重;3%水合氯醛溶液麻醉后,眶窦采集静脉血,检测血脂、血浆TMAO含量,油红染色检测主动脉根部动脉粥样斑块面积、免疫组化法检测斑块内炎性因子IL-6、MCP-1的表达情况;采用分子对接方法,明确TMAO配体与AT1受体是否能够稳定结合,二者之间是否存在相互作用;组织学水平:采用Western Blot方法检测整条主动脉AT1R表达及其下游信号分子蛋白激酶C（Protein kinase C,PKC）、细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinases,ERK1/2）的磷酸化水平,明确TMAO是否具有激活AT1R信号通路的作用;细胞学水平:构建含有AT1R目的基因的重组质粒,转染HEK-293T细胞,在不同时间点（0min、5min、10min、15min、30min、60min）加入TMAO（200umol/l）,提取不同时间点的蛋白,进一步验证TMAO是否具有激活AT1R的作用,并观察在TMAO基础上加入TLM（1umol/l）的作用。结果:第一部分:替米沙坦治疗组与对照组相比,使得参与产生TMAO的6种肠道菌群（Anaeroplasiaceae,Bacteroideaceae,Clostridiaceae,Lachnospiraceae,Ruminoccaceae和Proteus）丰度及占比减少,同时使TMAO血浆含量下降（P=0.023）,动脉粥样硬化斑块面积减少（P<0.01）,并使斑块内炎性因子IL-6、MCP-1表达减少（P<0.01）,血压（P<0.001）、体重下降（P=0.005）,血脂无差异。第二部分:1.分子对接结果提示TMAO借助于氢键、阳离子-π键等作用深埋于AT1R蛋白分子内部,与其稳定结合,间接证实了二者间相互作用。2.与对照组相比:TMAO组主动脉根部斑块面积增加（P=0.0468）及血浆TMAO含量增加（P=0.002）;与TMAO组对比:TMAO+TLM组主动脉根部斑块面积（P=0.0092）及血浆TMAO含量减少（P=0.030）,该结果说明1%胆碱可明显提高血浆TMAO含量,造模成功,同时再次验证了替米沙坦能够使TMAO血浆含量降低;TLM亦可以改善高水平的TMAO所加重的动脉粥样硬化。3.血浆中高密度脂蛋白（high-density lipoprotein,HDL）含量:CTL组含量最高,与TMAO组（P=0.018）和TMAO+TLM组（P=0.018）相比具有统计学差异,其余血脂指标甘油三酯、低密度脂蛋白、总胆固醇含量在三组小鼠中无差异。4.Western Blot检测小鼠主动脉组织中蛋白表达情况:与CTL组对比:TMAO组AT1R（P=0.001）、磷酸化细胞外调节蛋白激酶（Phosphorylated extracellular regulatory protein kinases,p-ERK1/2）（P=0.019）、磷酸化蛋白激酶C（Phosphorylated protein kinase,p-PKC）（P=0.027）表达水平增加;与TMAO组对比:TMAO+TLM组AT1R、p-ERK1/2、p-PKC（P=0.009、P=0.031、P=0.019）表达水平下降,说明TMAO在小鼠主动脉组织中具有激活AT1R信号通路的作用,给予TLM干预后,这一作用被阻断。5.构建AT1R真核表达质粒,并转染HEK293T细胞,加入TMAO（200umol/l）后,ERK1/2在15min、30min（*P=0.021、**P=0.037）磷酸化水平增加,PKC在10min、15min（*P=0.046、**P=0.01）磷酸化水平增加;TLM（1umol/l）干预后ERK1/2及PKC磷酸化水平与对照组相比无统计学差异（P>0.05）,这一结果进一步支持了TMAO具有激活AT1R的作用。结论:1、TMAO加重动脉粥样硬化的机制,可能与TMAO激活AT1R信号通路有关;2、血管紧张素受体阻滞剂减轻动脉粥样硬化的机制:1)可能与改变肠道菌群组成,使TMAO血浆含量减少有关。2)阻断TMAO与AT1R结合。