在自然界中,内生真菌与植物的互惠共生是一种非常重要并且复杂的互作关系。内生真菌因其具有促进宿主植物营养吸收、抵抗外界生物和非生物胁迫等作用,而越来越受到研究人员的重视。本课题组前期研究从重阳木茎内皮中筛选出一株拟茎点霉属内生真菌(Phomopsis liquidambari,编号B3),发现其在体外培养条件下不仅能够分泌生长素(IAA)、脱落酸(ABA)以及维生素B1等生长调节物质,而且能够降解含氮杂环吲哚和多环芳烃菲。同时,前期的研究发现B3在分解植物凋落物过程中,可有效释放NH4+,提高土壤中矿质N的含量。另外,前期的研究中发现B3能与水稻共生,促进水稻生长和分蘖,提高水稻产量,同时能够在减少部分氮肥施用的情况下保证水稻不减产。这些结果都预示着内生真菌B3可能在水稻氮素利用上存在有益的效果,但是B3促进水稻氮素利用的具体效果以及其潜在机理尚不明确。因此,本文尝试从植物生理及土壤微生物生态等角度全方位探索内生真菌B3对水稻氮素利用的影响及其潜在机理。首先,为了确认内生真菌B3与水稻的共生关系,我们通过聚乙二醇(PEG)介导的化学转化方法,利用含绿色荧光蛋白(GFP)基因和潮霉素抗性(HYG)基因的载体pCT74构建了 GFP标记的B3菌株。通过利用GFP-B3对水稻种子进行浸种催芽,建立了水稻与B3的共生体系。通过荧光显微镜的观察,我们发现B3能够系统性定殖于水稻体内,水稻根部和地上部分均能观测到GFP-B3的存在。其次,利用B3浸种催芽建立的B3与水稻共生(E+)和非共生(E-)的实验体系,在盆栽实验条件下设置了低、中、高(1.25、2.5、3.75 g N盆-1)三个氮肥水平,进一步探究内生真菌B3对宿主水稻氮素利用的影响。结果表明:在低氮条件下,水稻生长的全生育期内,内生真菌共生组水稻的生物量和氮素含量均显著高于非共生组;内生真菌共生组水稻体内的总氮含量相比于非共生组,在水稻苗期、分蘖期、抽穗期和成熟期分别提高了 29.05%、14.65%、21.06%和18.38%;收获后,内生真菌共生组水稻产量和氮肥利用效率(NUE)相比于非共生组,分别提高了 12%和11.59%。同时,在低氮条件下,内生真菌共生显著影响了水稻地上部分和根部的氮代谢关键酶:硝酸还原酶(NR)和谷氨酰胺合成酶(GS)的活力。从苗期到抽穗期,内生真菌共生组水稻地上部分和根部的NR和GS活性均显著高于非共生组。此外,在低氮条件下,内生真菌共生还显著提高了水稻根部和地上部分NH4+、NO3-、游离氨基酸及可溶性蛋白的含量。以上实验结果证实了内生真菌与水稻共生过程中,B3对水稻氮素积累和代谢的增益效应。第三,为了探究内生真菌B3促进水稻氮素利用的机理,我们尝试从水稻土壤氮素营养的角度,探究B3共生是否会影响水稻根际土壤中的氮素营养。实验同样利用盆栽条件下的水稻共生和非共生体系,在低中高三个氮肥水平下探究内生真菌共生对水稻根际土壤中总氮、铵态氮和硝态氮含量的影响,以及对根际土壤氮转化相关微生物:氨氧化细菌、氨氧化古菌和固氮菌的群落丰度和结构的可能影响。实验结果表明:在低氮条件下,内生真菌B3共生组水稻根际土壤中的铵态氮和硝态氮含量均显著高于非共生组水稻根际土壤,但是总氮含量无显著差异;内生真菌共生组水稻根际土壤中氨氧化细菌、氨氧化古菌和固氮菌的丰度显著高于非共生处理组,三种氮转化相关微生物区系也显著区别于对照。进一步探究共生组和非共生组水稻根际分泌物的差异发现,在低氮条件下,内生真菌共生组水稻根际分泌物中可溶性糖、小分子有机酸、游离氨基酸含量均显著高于对照组。我们的实验结果表明可能是内生真菌B3与水稻共生后,影响了水稻的生理状态,使水稻根系分泌更多的分泌物到根际环境中,这些分泌物作为营养物质刺激了根际氮转化相关微生物的生长,最终使水稻根际土壤中可用氮含量增加,有利于水稻生长和氮素利用。第四,为了进一步探究内生真菌B3共生促进水稻氮素吸收和代谢的机理,我们通过水培实验,在三个氮肥水平下测定了 B3共生对苗期水稻的根部和地上部分氮素吸收转运蛋白基因和同化关键酶基因的转录水平的影响,期待发现能被内生真菌B3特异性诱导的水稻氮吸收和代谢相关基因。实验结果表明:在低氮水平下,内生真菌共生能够特异性诱导水稻组织中氮素吸收相关蛋白基因(OsAMT1;1、OsAMT1;3、OsAMT2;2、OsAMT3;2、OsAMT3;3、OsNRT2;1)和N代谢关键酶基因(OsNR1、OsGS1、OsGS2、OsNADH-GOGAT)的表达上调,从而促进水稻氮素的吸收和代谢。