研究背景生物体内的无机矿物组织是通过复杂的生物矿化过程而形成,从材料科学的角度来看,其形成过程可以视为由纳米尺度的结构单元逐级组装而构建生成,骨、齿科修复材料植入人体组织后其表面类骨矿物材料的形成、长大及结构演变过程是材料具有优异适配性的核心问题。研究类骨矿物形成过程、基质蛋白对类骨矿物的分子识别机制、生物微环境对类骨钙磷矿物的精确调控机理,从一个侧面为植入材料的生物适配理论提供基础,并为新型骨、齿科修复材料的功能化设计提供理论依据。目前组织工程学及再生医学领域的理想结果是生物材料可以增强细胞分化,促进局部自身修复。在临床上目前应用最广泛的骨科金属植入材料依然是钛及其合金,其优点是拥有良好的耐腐蚀性及生物相容性,但也因其自身的生物活性不高,缺乏与周围组织的有效结合,导致了较低的骨整合能力。有研究指出,与生物活性较好的材料相比,其促进骨整合的时间要晚几个月甚至更长时间。甚至可以使得1.5%～2.5%的髋、膝关节置换患者存在因为感染导致手术失败的风险。因此,人们希望在保留钛及其合金原有优势的基础上,通过不同的方式来提高它的生物活性,取得更满意的临床疗效。纳米技术近年来已经渗透到医疗行业的各个领域。有研究发现当物质的结构单元(如晶粒或孔隙)小到纳米级,其性质就会发生重大改变,不仅改善了原来材料的性能,甚至可以使材料本身具有新的性能或效应。使得它们在光学、催化、热学、光化学以及敏感特性等方面具有一系列独特的新特性。已有大量研究表面纳米表面可影响细胞的生物学行为。Dalby等发现纳米结构可促进人成纤维细胞生长。Sjostrom通过铝模版构建不同规格的纳米棒,结果表明可以明显促进骨髓间充质干细胞增殖和分化。目前报道的已有的纳米植入材料有纳米陶瓷,纳米纤维,纳米复合物等。通过不同的方法,可以获得不同表面形貌的纳米化结构,而他们对细胞都具有不同程度的影响。有学者认为,之所以会产生不同影响,主要是表面形貌通过对细胞外基质中蛋白粘附及对细胞粘附的调节产生的。细胞表面的受体可以识别并结合特定的细胞外基质中结合蛋白的形状,并与材料相结合。不同的纳米表面形貌可以对细胞外基质中的整合蛋白产生不同的调节作用。这些整合蛋白受体与细胞骨架相互作用,可以影响细胞的形状,增殖及分化等方面。近年来,很多研究证明纳米棒、纳米管等多种纳米化表面材料在对细胞的生物相容性调控方面优于纯钛,不同长度的纳米棒及不同管径的纳米管都对细胞有不同程度的影响,这说明不同的纳米形貌对细胞的作用大相径庭,而以往的研究中,更多的是以纯钛作为对照,较少有文献报道不同纳米形貌间对细胞的影响差别。骨髓间充质干细胞是近年来的研究热点,其在不同的诱导作用下可以向不同的分化方向,正是这种多向的分化功能,使得它成为组织工程中重要的种子细胞。已有研究证明利用骨髓间充质干细胞可以更好的修复自身组织损伤,其与纳米化钛合金材料的共同应用已经运用于口腔科及整形外科的治疗当中。本实验通过碱热处理方法,通过调控温度的高低制备出纳米网、纳米叶、纳米针及纳米线四种不同纳米表面结构,通过与小鼠骨髓间充质干细胞共同培养,观察细胞形状,对比细胞粘附、增殖及成骨矿化的指标对比四种纳米形貌对小鼠骨髓间充质干细胞生物活性影响的区别,并发现对细胞生物活性更有利的表面形貌。研究目的1.利用碱热处理方法,通过调控不同温度,获得四种不同的表面形貌纳米化材料,对各组材料的特性予以分析。2.体外培养小鼠骨髓间充质干细胞,与各组材料共培养,利用钙黄绿素法对死活细胞进行染色,检测材料的生物安全性,为进一步的生物活性研究奠定基础。3.将小鼠骨髓间充质干细胞与各组材料分别共同培养,利用扫描电镜观察不同的纳米表面形貌对细胞形状的影响。4.依次检测各组材料对小鼠骨髓间充质干细胞的粘附、增殖能力的指标,对比发现各组材料对细胞生物相容性的不同作用效果。5.检测各组材料对小鼠骨髓间充质干细胞骨向成骨分化能力的影响,对比各组间的区别。研究方法1.利用碱热处理法加工医用钛片,高温高压处理时分别将温度调整为80℃,100℃,1200℃,140℃,依次制备出四种不同表面形貌的纳米化材料,利用X射线衍射仪,分析其衍射图谱及组成成分,同时应用场发射扫描电镜观察不同表面形貌的区别。2.体外复苏、培养小鼠骨髓间充质干细胞,将细胞与各组材料分别共培养,利用钙黄绿素法对死活细胞进行染色,通过观察细胞染色情况,并结合共培养后细胞增殖情况观察各组材料对细胞的毒性反应,进一步评估其生物安全性。3.将小鼠骨髓间充质干细胞与各组材料共培养24h,通过脱水、喷金等处理后利用扫描电镜观察各组材料表面粘附的细胞形态,对比各组材料表面细胞形态的区别。4.将四种材料与小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)复合培养,利用DAPI法研究细胞30min、60min及120min的在材料表面的早期黏附情况；采用MTT法检测小鼠骨髓间充质干细胞在四组材料表面第1、3、5天增殖活力。对比不同种材料对细胞生物相容性的不同影响,进一步评估四种材料的在生物相容性方面的差异。5.利用免疫荧光法观察各组材料表面粘附的细胞骨架形态,观察并对比不同纳米化表面对细胞骨架的影响及差异；将小鼠骨髓间充质干细胞与四组材料复合培养14天后,采用p-NPP法测定细胞内碱性磷酸酶含量,用胞内总蛋白进行标准化,观察四组材料对MSCs细胞的成骨分化的影响；MSCs细胞与四组材料复合培养21天后进行酋素红染色后,利用氯化十六烷吡啶溶解钙结节后定量分析四种材料对MSCs矿化的影响。6.统计学处理：所有数据均采用“均数±标准差”表示,应用SPSS13.0进行统计学分析。各组间数据采用析因设计方差分析、One-Way ANOVA进行统计学分析,两两比较采用LSD法。方差不齐时,采用Dunnetts T3比较。α=0.05,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果1.利用碱热处理法加工生物医用钛片,通过调控加工过程中的温度,分别在钛片表面获得了四种不同的纳米化形貌的材料,通过扫描电镜观察,发现温度从低到高分别获得了纳米网、纳米叶、纳米针及纳米线四种不同的纳米表面形貌。能谱分析结果显示四种纳米化表面材料的表面元素组成及元素的比例,结果提示四种材料表面组成一样,都完全是Ti元素。2.利用钙黄绿素法对复合培养的细胞进行染色,结果观察发现视野下所观察到的四种材料表面的细胞绝大部分都被染色为代表活细胞的绿色荧光,说明各组材料均没有细胞毒性,为进一步实验研究奠定了基础。3.通过扫描电镜结果发现,纳米网状结构对细胞形态具有最好的诱导性,表面粘附的细胞与材料结合的最紧密,有板状突起伸出,纳米叶状结构表面细胞形态较好,纳米针及纳米线结构表面细胞与材料贴合不够紧密,细胞形态较细长。四种材料对细胞形态影响的顺序依次为：纳米网>纳米叶>纳米针>纳米线。4. MSCs在不同表面上30min,60min及120min的黏附结果表明：四组材料与细胞复合培养30min后,四组材料表面粘附的细胞数量无统计学意义(P>0.05)；复合培养60min后,各组材料表面黏附的细胞明显较30min多,纳米网状结构表面黏附的细胞数量均较其余三组材料多,有统计学意义(P<0.05),纳米网>纳米叶>纳米针>纳米线。复合培养120min后,各组材料表面黏附的细胞明显较30min和60min多,纳米网状结构表面黏附的细胞均较其余三组材料多,有统计学意义(P<0.05),纳米网>纳米叶>纳米针>纳米线。5. MSCs细胞与四种材料复合培养后,在第1天,3天和5天的细胞增殖活力比较结果表明：各组材料的细胞生殖活力有显著性差异(P<0.01),每组材料的OD值随着时间而增加,符合细胞的生长曲线。细胞培养1天后,四组材料的OD值相比无统计学意义(P>0.05)；培养3天后,纳米网状结构表面的OD值高于其余三组材料,且有统计学意义(P<0,05)；培养5天后,纳米网状结构表面的OD值仍然高于其余三组材料,并且有统计学意义(P<0.05),表明纳米网状结构表面的增殖活力均其余三中纳米形貌强。其次是纳米叶状结构组,纳米针状结构组次之,纳米线状结构组材料的细胞增殖活力最小。6.细胞与材料共培养24h后利用TRITC染色在正置荧光显微镜下观察到的细胞骨架情况。与扫描电镜结果相似的是,80℃下纳米网状材料表面细胞较其他组铺展的面积较大,其他组,尤其是纳米针及纳米线组材料表面细胞虽有丝状伪足突出,但整体形态较细长,或为不规则形。7.ALP检测结果显示,培养14天后MSCs细胞在纳米网状结构表面的ALP活性高于对其余三种纳米化表面,且有统计学意义(P<0.05)。其余三种材料ALP活性的比较：纳米叶>纳米针>纳米线。8.茜素红染色法检测MSCs细胞在不同试样上培养21后的矿化程度,通过溶解钙结节后定量分析的结果表明：纳米网状结构表面材料的矿化程度最高,较其余三种纳米形貌有统计学意义(P<0.05)。结论1.本研究中,通过调控碱热处理法中高温高压处理时的温度可以获得不同的纳米化表面形貌,在工艺及材料制备方面均有一定的创新性。2.利用钙黄绿素染色法证明了四种不同纳米化表面形貌的材料均没有细胞毒性,对该批纳米化表面材料后续的生物相容性研究有重要的参考意义,也证明了通过碱热处理法制备的表面纳米化材料可以作为一种安全的植入性材料。3.扫描电镜实验结果证明纳米网状结构可以更好的调控表面粘附的细胞形态,并与细胞结合的更为紧密,说明与另外三个表面形貌相比,纳米网状结构在对调节细胞形态方面更具有优势。4.细胞粘附、增殖结果证明纳米网状结构在体外对骨髓间充质干细胞的生物相容性的调节更具有优势,纳米叶、纳米针及纳米线对骨髓间充质干细胞的调节作用依次减弱。5.纳米网状结构在体外对骨髓间充质干细胞的成骨矿化能力的调节更具有优势,纳米叶、纳米针及纳米线对骨髓间充质干细胞的调节作用依次减弱。