菊花(Chrysanthemum×morifolium Ramat.)是我国传统十大名花和世界四大鲜切花之一,近年来利用植物基因工程技术培育菊花新品种已经成为研究热点,并取得了初步成果。目前在菊花转基因研究中主要使用花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子,该启动子为组成型表达启动子,在转基因植株的各个器官和生长发育的所有时期均表达,容易打破转基因植株的代谢平衡,对其正常生长发育造成影响,有时在转基因植株中还易引起外源基因的沉默。诱导型启动子可以利用外界物理或化学条件的变化启动其表达活性,在非诱导条件下其在转基因植株中表达水平较低,对受体植株的伤害较小,因此利用诱导型启动子进行菊花转基因工程研究,具有重要的理论和实践意义。甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase, BADH)基因是甜菜碱合成途径中的重要基因,植物中研究表明该基因的表达受干旱、盐、ABA和低温等的胁迫诱导。本课题组前期已经从菊科菊属植物甘菊[Chrysanthemum lavandulifolium (Fisch. ex Trautv.) Makino]中克隆得到了4个BADH基因启动子序列DBP11、DBP12、DBP21和DBP22 (GenBank登录号分别为DQ497620-23),并利用瞬时表达分析证明4个序列均具有启动GUS报告基因的功能。本研究在此基础上利用转基因的方法研究4个启动子的胁迫诱导活性,并选取其中表达活性较高的启动子进行缺失试验,研究其上顺式作用元件的功能。本研究主要取得如下成果：1.利用实时荧光定量PCR和雷氏盐紫外分光光度计法分别测定了400mmol／LNaCl胁迫处理0h、0.5h、2h、12h、1d、2d、4d、6d、8d、10d和12d,20%PEG-6000胁迫处理0h、0.5h、2h、12h、1d、2d、6d,甘菊叶片中BADH基因表达量和甜菜碱含量的变化。试验结果表明：在高盐胁迫下甘菊叶片中BADH基因表达量和甜菜碱含量均呈现先上升后下降的趋势。在处理初期(0.5h和2h)BADH基因的表达量与对照相比略有下降,此后随处理时间的增加BADH基因表达持续增大,在胁迫处理6d时BADH基因表达量最大为对照的4.6倍,此后BADH基因表达量逐渐降低。甜菜碱含量在NaCl处理0.5h明显增加,此后其含量出现了小幅的震荡上升,在胁迫处理4d时达到了最大值,之后随胁迫处理时间的增加甜菜碱含量逐渐降低。二者之间的变化并不是同步的,而是存在滞后性,分析认为甘菊叶片中BADH基因表达与甜菜碱积累间存在相互抑制的作用。甘菊BADH基因在20%PEG-6000胁迫处理0.5h表达量明显增大,之后活性降低,在胁迫处理1d时表达量达到最大值。2.将甘菊BADH基因启动子DBP11、DBP12、DBP21和DBP22与GUSplus报告基因融合构建植物表达载体,转化烟草。对转基因植株进行NaCl、干旱、ABA、SA和低温胁迫处理,通过测定GUS活性鉴定启动子的诱导性。结果表明：DBP11、DBP12和DBP21启动子均响应NaCl、干旱、ABA和低温胁迫处理,其中DBP12启动子诱导活性更强,DBP22启动子只响应NaCl和低温胁迫处理,且其基本活性仅为DBP11、DBP12和DBP21的0.1倍。3.选取诱导活性较强的DBP12启动子,根据其上顺式作用元件的分布位置设计不同的引物,利用PCR的方法对DBP12启动子进行5’和3’端缺失,将7个缺失片段与GUSplus报告基因融合构建植物表达载体。用农杆菌介导的叶盘转化法转化甘菊叶片,瞬时表达的结果表明,7个载体构建成功。4.将7个DBP12启动子的缺失片段转化烟草,对转基因植株进行NaCl、干旱、ABA和低温胁迫处理,利用GUS活性变化检测启动子各片段的表达差异。DBP12启动子上同时含有抑制子和增强子；在DBP12启动子上响应NaCl、干旱、ABA和低温胁迫诱导的顺式作用元件为MYB、MYC识别位点和ACACNNG core;同时DBP12启动子上所含有的抑制子也和顺式元件一起共同作用调控BADH基因对胁迫信号的响应；此外BADH基因对于启动子基础活性及响应干旱、NaCl、ABA和低温诱导具有重要作用,5’-UTR对于BADH基因响应低温胁迫诱导的作用是唯一的。5.利用接头染色体步移法,以甘菊盐胁迫条件下表达的6条EST序列为基础,从甘菊Genome Walker库中克隆得到了其中4条片段上游DNA序列,经启动子软件分析结果显示,片段24.1(ADP核糖焦磷酸水解酶基因)上含有与水分和生物胁迫相关的顺式作用元件。利用双酶切的方法将克隆得到的24.1启动子片段替换载体pBI121上的35S启动子,将新构建的植物表达载体转入农杆菌中,并用叶盘法侵染甘菊和菊花叶片,进行瞬时表达研究。试验结果表明,所克隆的24.1的启动子片段具有驱动下游报告基因表达的功能。本研究鉴定了甘菊BADH基因启动子响应干旱、高盐、ABA和低温胁迫诱导的顺式作用元件的种类和分布的位置。为菊花转基因工程中诱导型启动子的应用奠定了基础。