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马疱疹病毒1型（Equine herpesvirus-1,EHV-1）和马疱疹病毒4型（Equine herpesvirus-4,EHV-4）是马鼻肺炎（Equine rhinopneumonitis,ER）的病原体,均能引起马属动物呼吸系统疾病。然而,EHV-1除了可以引起马匹呼吸系统疾病以外,还能导致孕马流产及新生马驹死亡,是一种引起马匹不同临床综合征的病原体,给马产业造成严重的经济损失。目前,预防该疾病最有效的手段仍是疫苗接种,而我国尚无商品化疫苗。因此,研制安全有效的EHV-1灭活疫苗具有重要的现实意义。1.将纯化后的EHV-1 XJ2015株病毒液进行10倍梯度稀释,采用10~6、10~5、10~4和10~3TCID50/m L的病毒液分别经鼻腔感染各组试验马匹,通过比较分析其临床症状、鼻腔排毒量、病毒血症、各组织脏器病毒载量以及病理组织学变化,建立EHV-1 XJ2015株马体疾病模型。并建立临床评分表,通过设定感染马匹在试验期间连续2 d临床症状分值>1分,或总分值>3分者判为发病,计算EHV-1XJ2015株对马匹的半数感染量。结果表明,感染发病的马匹表现发热,体温超过38.8℃,食欲不振、流黏脓性鼻液和下颌淋巴结肿大,严重者出现起卧困难、运步拖沓,反复起卧等临床症状,发病率与感染剂量呈正相关,其ID50为104.33TCID50/m L;病毒大量富集于马匹的肺脏和脑中,并出现间质性肺炎及神经元水肿等明显的病理变化。2.本研究采用EHV-1 XJ2015株作为种毒接种RK-13细胞进行病毒扩增,经饱和硫酸铵沉淀法浓缩病毒,蔗糖密度梯度离心纯化病毒,将1 L效价为109.66TCID50/m L病毒原液经浓缩纯化后,可获得2 m L效价为1012.19TCID50/m L病毒纯化液,回收率为67.77%,杂蛋白去除率为97.25%。病毒液经0.02%的β-BPL作用24 h即可完全灭活,37℃水解2 h后分别用A、GEL-02、ISA35-VG佐剂在低剪切力下与已灭活的病毒混合制备成三种不同佐剂的EHV-1灭活疫苗。3.采用病毒效价为10~8、10~7、10~6TCID50/m L的灭活病毒经颈部肌肉注射免疫各组试验马匹,2次免疫后42 d用100 ID50进行攻毒保护试验,通过临床症状、鼻液和血液中的病毒含量及持续时间评价灭活疫苗的免疫效力,并确定保护率及最佳免疫剂量。结果显示,10~8TCID50/m L和10~7TCID50/m L灭活病毒免疫组马匹均未发病,保护率均为100%,10~6TCID50/m L灭活病毒免疫马匹保护率为50%;10~8TCID50/m L免疫组鼻液、血液中的病毒含量较少,且持续时间短,保护效果最佳。将最佳免疫剂量分别与A、GEL-02、ISA-35VG佐剂制备疫苗,通过马体免疫试验筛选最佳佐剂。结果表明,A佐剂疫苗免疫组抗体水平最高,2次免疫后中和抗体平均为1:350,与Ag对照组相比差异性极显著（P<0.01）,与Ag+GEL-02、Ag+ISA-35VG组相比具有显著性差异（P<0.05）。表明A佐剂制备的灭活疫苗体液免疫应答水平最高,因此筛选为最佳佐剂。综上所述,本实验成功建立EHV-1 XJ2015株马体疾病模型,通过攻毒保护试验评价疫苗免疫效力,将最佳免疫剂量与A佐剂配置疫苗免疫马匹后,免疫效果最优,为后期生产商品化疫苗奠定了理论基础。