金黄色葡萄球菌(金葡菌)是社区和医院感染的主要病原菌,由于抗生素的广泛应用,产生了大量难治的耐药菌群,常规抗生素对耐药金葡菌所致的感染已经没有治疗效果,目前以万古霉素为代表的糖肽类抗生素是治疗耐药金葡菌感染最有效的药物,但万古霉素毒性大,限制了其在临床的大量使用。而且,自1996年至今,全球范围内已报道多例对万古霉素耐药(VRSA)或中介耐药(VISA)的病例。针对金葡菌日益增强的耐药性,而抗生素疗效愈来愈下降的迫切现状,如何研发更有效的药物治疗金葡菌感染,同时减轻药物毒性和防止耐药性的产生已成为抗感染治疗亟待解决的问题。溶葡萄球菌酶(lysostaphin)的发现给耐药金葡菌感染的治疗带来了希望。它是从模仿葡萄球菌(staphylococcus simulans)中分离出来的一种含锌的金属蛋白酶,能特异性水解细菌胞壁肽聚糖交联结构Gly五肽桥联而产生破壁溶菌作用。由于Gly五肽桥联结构仅大量存在于葡萄球菌细胞壁,其中又以金葡菌细胞壁中分布最广,因此,溶葡球菌酶主要对葡萄球菌,尤其对金黄色葡萄球菌有强大的杀灭作用。与抗生素干扰细菌的生长期不同,溶葡球菌酶的破壁活性不受细菌生长周期影响,对静止和活动期葡萄球菌均有杀灭作用,而且不易产生耐药性。这些特性使之成为国内外专家研发抗耐药金葡菌制剂的重点目标之一。但是由于天然的溶葡萄球菌酶产量少,难以纯化,限制了人们对其进行深入的研究和开发。直到20世纪90年代,随着基因工程技术和蛋白质纯化技术的发展,人们才逐渐建立了一些重组溶葡萄球菌酶的表达系统,但是仍然存在以下问题,有待进一步优化和完善:①表达蛋白无生物学活性或活性很低,有的重组蛋白比天然溶葡萄球菌酶活性低10-16倍;②重组蛋白的产量不理想;③蛋白纯化方法烦琐,时间长,纯化过程导致重组蛋白的生物活性丢失,表达蛋白只适用于实验室进行结晶学研究;④对表达蛋白的酶活性研究仅仅限于酶活力单位的测定;⑤溶葡萄球菌酶的空间结构和酶分子特性仍然不明确。这些问题阻碍了人们对溶葡萄球菌酶在人体内应用的安全性、有效性和稳定性进行深入的研究,这极大地限制了溶葡萄球菌酶的开发和应用。鉴于以上的问题,我们选用了目前表达重组蛋白功能最强大的pET系统,在大肠埃希菌中表达重组溶葡萄球菌蛋白,摸索优化条件以提高蛋白产量,并对表达蛋白的酶活性进行了更加深入的研究,测定了其抗菌谱,比较了其与万古霉素等临床常用抗生素的抗菌效力,最后检测了影响重组蛋白酶活力的因素,初步分析了其酶分子特性。本课题研究的主要内容和结果如下:1.构建原核表达载体和优化表达目标蛋白:我们以pRG质粒为模版,通过PCR选择性地扩增溶葡萄球菌酶基因,双酶切后与载体pET-42a(+)连接,构建了重组质粒,并经基因测序证实结果正确,表明原核表达载体构建成功,重组质粒命名为pET42lys。本研究选用的pET原核表达系统是目前在大肠埃希菌(E.coli)中克隆表达重组蛋白功能最强大的系统,蛋白表达由宿主菌提供的T7RNA聚合酶诱导,非诱导条件下则不存在基础转录,从而使克隆与表达很好的分离。本实验目的基因克隆入载体后,重组质粒首先选用不含有T7RNA聚合酶基因的宿主菌(DH5a)进行克隆,这就避免了对宿主细胞有毒的蛋白产物对质粒稳定性的影响;完成克隆后,将其转入染色体上带有lacUV5调控的T7RNA聚合酶基因的表达宿主菌BL21(DE3)plysS中,用IPTG诱导即可表达目的蛋白。本实验需要大量的目标蛋白用于后续实验,因此,我们对表达条件进行了优化,摸索到的最佳表达条件为:25℃诱导6h, IPTG浓度为1mmol/L。用Bio-Rad Quantity One软件分析,重组蛋白表达量可达到菌体总蛋白的40%,高于文献报道的20%。目标蛋白主要以包涵体形式表达,少量为可溶性表达,这和文献报道中均以可溶蛋白表达的结果不同,形成包涵体的原因可能是表达效率太高所致。2.重组溶葡萄球菌蛋白的纯化、复性及鉴定:本研究选用了固定化金属离子亲和层析法(IMAC)纯化蛋白,它的优点是金属离子配基具有很好的稳定性,吸附量大,成本低,纯化时间短,但也有会发生非特异性吸附的缺点。可溶蛋白的纯化效果不理想,纯度仅为80%,说明针对可溶蛋白的最佳纯化方案还有待于进一步摸索。包涵体获得了较高的纯化效率,纯度在95%以上,BCA法蛋白定量测得纯化后可溶蛋白的浓度为1151.53μg/ ml,包涵体浓度为1869.54μg/ ml。1L菌液纯化后获得15.34mg重组蛋白,产量高于文献报道的11mg。包涵体需要复性后才能恢复蛋白的生物学活性,本实验选用了最常用的透析复性方法。利用免疫印迹法分析鉴定纯化后蛋白,目标蛋白与抗His.Tag单克隆抗体反应,在分子量约27kDa处出现特异表达的蛋白条带,与预测基本一致,结果显示成功获得了较高纯度的重组溶葡萄球菌蛋白。3.重组溶葡萄球菌蛋白体外抗菌活性的研究:通过对重组溶葡萄球菌蛋白抗菌谱的初步测定,发现其对肺炎球菌、白色念珠菌及铜绿假单胞菌等11种33株临床分离株均没有杀菌效力,仅对葡萄球菌有杀菌活性,但对金葡菌的杀菌活性显著大于其它葡萄球菌。我们采用微量稀释法测定了重组溶葡萄球菌蛋白对金葡菌的体外抗菌效力,结果证实,重组溶葡萄球菌蛋白有强大的杀菌活性,不仅对金葡菌敏感株有良好的抗菌作用,对临床上难治的MRSA的杀菌效果也非常突出,MIC在0.003～0.78μg/ ml之间,MBC在0.39～3.125μg/ ml之间。与传统抗生素比较,重组蛋白的抗菌活性不仅显著优于新青Ⅱ和克林霉素,还优于目前杀菌效果最好的万古霉素。我们采用分光光度法测得重组溶葡萄球菌蛋白比活力是10150u/mg,这和文献报道的970～11900 u/mg接近。酶活力越高,酶催化某一反应的速度就越快,而比活力越高,表明酶越纯,因此可以认为重组溶葡萄球菌蛋白纯度高,抗菌活力强,这进一步印证了本实验关于重组溶葡萄球菌蛋白具有强大的体外抗菌活性的研究结果。本实验中发现纯化后的包涵体不仅有抗菌活性,而且大于可溶蛋白的活性,复性后包涵体却无杀菌活性。这不同于“包涵体需要复性才能恢复活性”的传统理论。而最近的研究结果显示,在包涵体中的蛋白质不全是非天然状态,包涵体中存在的一些小分子热激蛋白质(IbpAB)使某些较稳定的蛋白质依然维持了原有的立体结构和活性。本研究的结果也推测,包涵体并不全是因错误折叠形成的无用的副产物,仍然有一些包涵体蛋白具有天然的结构和活性。包涵体复性后无抗菌活性的问题可能是未摸索出包涵体复性的最佳条件,由于纯化后的包涵体已有良好的生物学活性,因此我们将在以后的实验中继续摸索包涵体的最佳复性条件。4.影响重组溶葡萄球菌蛋白活力因素的检测:目前应用基因工程技术表达生物活性多肽的一个重要问题,就是表达肽的稳定性,即在酸、碱环境,温度等条件变化时,表达肽是否仍能够保持良好的生物活性。我们分析了pH值、底物浓度、孵育温度和作用时间这四个因素对重组溶葡萄球菌蛋白活力的影响。实验发现重组溶葡萄球菌蛋白的最适pH值为3～4,在pH值为3～6时,酶活力比较稳定,说明重组溶葡萄球菌蛋白耐酸性能好。重组蛋白的最适温度为50℃,和文献报道的45～48℃接近。重组蛋白的酶活力还随着底物浓度的增加和作用时间的延长而增加,这些性质与酶的基本特性相吻合。综上所述,我们成功构建了原核表达载体pET42lys,重组质粒转化大肠埃希菌后获得了较高产量的重组溶葡萄球菌蛋白。重组溶葡萄球菌蛋白有良好的生物学活性,抗菌效力显著优于包括万古霉素在内的传统抗生素。本实验的研究结果对进一步研究溶葡萄球菌酶的结构、酶分子特性和功能有一定的借鉴意义;也为后期在临床上进一步开发和应用溶葡萄球菌酶治疗金葡菌感染奠定了基础。