到目前为止,国内外对RhoA蛋白功能的研究主要基于其在细胞质和细胞膜的分布上,关于其在细胞核内的定位及其入核机制,尚未见明确报道。此项目在本实验室首先发现RhoA蛋白在人胃癌细胞系SGC-7901的细胞核内有分布的基础上,以多种癌组织和癌旁组织、癌细胞系和转化细胞系为研究对象,在较大范围内系统地研究RhoA蛋白在细胞核内的分布以及这种分布与细胞恶变的关系,并且进一步阐明影响其进入细胞核的因素,探讨RhoA蛋白进入细胞核的机制。研究结果将既有助于全面认识RhoA蛋白在细胞内的功能,又有助于深入研究癌细胞发生发展的机制,为肿瘤的诊断和靶向治疗提供一定的理论依据。目的：(1)观察RhoA蛋白在癌组织及癌旁组织细胞、转化细胞系和癌细胞系细胞核内的分布,阐明RhoA蛋白在多种细胞核内分布的情况,并分析RhoA蛋白在细胞核内的分布与组织细胞恶变的关系。(2)观察癌细胞核内的RhoA是否存在碱基突变,明确RhoA在癌细胞核内的分布是否与其碱基突变有关。(2)观察在一些因素的影响下RhoA在细胞核内的分布,初步阐明其在细胞核内的分布变化可能有关的因素,初步探讨其进入细胞核的机制。方法：第一部分(1)用免疫荧光、免疫组化及Western Blot等方法,观察／检测内源性RhoA蛋白在人胃癌细胞株SGC-7901中的定位。(2)用三种编码不同结构RhoA的质粒DNA(野生型wt、结构活性型63L和无活性型N19)转染人胃癌细胞株SGC-7901,再提取细胞膜、细胞浆和细胞核组分,通过Western Blot方法检测外源性RhoA蛋白在细胞中的定位。(3)用免疫荧光法检测RhoA蛋白在人胃癌细胞株SGC-7901、子宫颈癌细胞株Hela、肺癌细胞株A549、结肠癌细胞株SW480细胞内的分布。(4)用免疫荧光及Western Blot法,观察RhoA蛋白在正常胃粘膜上皮转化细胞株GES和人胃癌细胞株SGC-7901中细胞内的分布差异。(5)用免疫组织化学法,观察RhoA蛋白分别在胃癌、乳腺癌、食道癌、结肠癌的癌组织、癌旁组织、坏死组织细胞中的分布。第二部分用RT-PCR方法扩增RhoA基因,进行测序,分析RhoA的碱基序列,以阐明RhoA蛋白在细胞核内的分布是否与该蛋白发生基因突变有关。第三部分(1)用Western Blot法,观察LPA (RhoA激动剂)、CPT-cAMP (RhoA抑制剂)引起的RhoA蛋白在人胃癌细胞株SGC-7901中的移位,即观察RhoA活性改变对其在细胞内分布的影响。(2)分别抑制RhoA蛋白的异戊二烯基化和甲基化,用免疫荧光方法观察RhoA蛋白的相关修饰对其在细胞内分布的影响。(3)用免疫荧光方法,观察在用地塞米松诱导SGC-7901细胞凋亡过程中,RhoA蛋白在细胞内分布的变化。(4)用H202作用SGC-7901细胞,通过免疫荧光方法,观察细胞损伤情况下RhoA蛋白在细胞内的分布。(5)用通过免疫荧光方法,观察泰素对RhoA蛋白在细胞内分布的影响。(6)用免疫荧光和Western Blot方法,观察LPS诱导SGC-7901细胞发生炎症反应时,RhoA蛋白在细胞内的分布；并观察P38 MAPK抑制剂(SB203580)对其分布的影响。(7)用免疫荧光法,观察出核转运抑制剂(LMB)对RhoA蛋白在细胞内分布的影响。结果：第一部分(1)内源性的RhoA在人胃癌细胞株SGC-7901的细胞膜、细胞浆和细胞核中均有分布。(2)外源性的RhoA在人胃癌细胞株SGC-7901的细胞膜、细胞浆和细胞核中均有分布。(3) RhoA蛋白分布于人胃癌细胞株SGC-7901、子宫颈癌细胞株Hela、肺癌细胞株A549、结肠癌细胞株SW480的细胞膜、细胞质及细胞核,但主要分布在细胞核。(4) RhoA蛋白在正常胃粘膜上皮转化细胞株GES和人胃癌细胞株SGC-7901的胞膜、胞浆和胞核中均有分布,且在SGC-7901细胞核内的含量明显高于GES细胞。(5) RhoA蛋白在胃癌、乳腺癌、食道癌、结肠癌四种组织不同部位的分布情况是：坏死癌组织细胞中的RhoA蛋白含量最高,且主要分布于细胞核中；癌组织中RhoA蛋白含量次之；癌旁组织中RhoA蛋白含量最少。第二部分在人胃癌细胞株SGC-7901中,RhoA基因没有发生碱基突变。第三部分(1)LPA能够引起RhoA从细胞浆向细胞膜和细胞核移位；CPT-cAMP能够引起RhoA从细胞膜和细胞核向细胞浆移位。(2)分别抑制RhoA蛋白的异戊二烯基化和甲基化,对其在细胞内的分布影响不明显,提示RhoA蛋白的修饰对其在细胞核内的分布影响不大。(3)细胞凋亡时,RhoA蛋白在细胞胞核内的分布减少,向细胞膜移位。(4)细胞损伤时,RhoA蛋白的表达量明显增多,且向细胞核内移位。(5)泰素能够使RhoA蛋白从细胞核向细胞浆及细胞膜移位,LPA加剧了这种移位,提示RhoA的移位与细胞内的微管结构有关。(6)以LPS作用细胞模拟炎症反应时,RhoA蛋白从细胞浆向细胞核移位明显,有的细胞甚至出现空浆现象,胞核明显移位向细胞一侧；P38 MAPK抑制剂(SB203580)在早期能够有效阻断LPS导致的RhoA蛋白进入细胞核。(7)出核转运抑制剂(LMB)对RhoA蛋白在细胞核内的分布影响不大。结论：(1) RhoA蛋白在细胞核中的分布是组织细胞共有的普遍现象,且它在细胞核内的分布与组织细胞的恶变有密切关系。(2) RhoA蛋白在癌细胞核内的分布与其碱基突变无相关性。(3) RhoA蛋白在细胞核内的分布受多种因素影响：①RhoA活性增高时,其从细胞浆向细胞膜和细胞核移位,RhoA活性降低时,其从细胞膜和细胞核向细胞浆移位；②细胞发生凋亡时,RhoA在细胞核内的含量减少,从细胞核向细胞膜移位；③细胞发生损伤和炎症时,RhoA含量增多,并从细胞浆向细胞核移位；④抑制微管结构改变的抗癌药物泰素可以阻断RhoA从细胞浆向细胞核移位；⑤蛋白修饰及出核抑制剂对RhoA在细胞核内的分布影响不大,RhoA蛋白进入细胞核的转运方式可能是一个扩散的过程。