肝癌是我国农村第二位、城市第三位癌症。中国肝癌死亡率为20.4／10万，占全部恶性肿瘤死亡的18.8％。肝癌的血供丰富，其生物学特性包括高度血管浸润及转移倾向，导致该疾病的预后不良。肝癌复发与转移是一个多步骤、多环节的过程，其分子机制涉及癌基因、抑癌基因、转移相关基因、生长因子及其受体、黏附分子、细胞外基质、血管形成等多个环节。近年来，对肿瘤血管的研究是一大热门。研究表明肿瘤的生长、转移与肿瘤血管形成密切相关，血管形成是肿瘤生长、侵袭、转移的基础。当肿瘤长到直径超过2mm³，若要继续生长必须依赖新生血管的生成。在正常情况下，血管内皮与周围基质以及影响血管生成的各种细胞因子和生长因子之间的相互作用受到严格的时空调控，然而在肿瘤发生发展过程中，病理性的血管发生却脱离了正常的调控系统，无限制的异常持续，所以多种参与调节血管发生的细胞因子在肿瘤中表达。VEGF被认为是最强的血管形成因子，VEGF表达水平反映了肿瘤血管内皮细胞增殖、迁移和血管构建的水平，直接反映肿瘤生长的速度和转移的倾向。VEGF能诱导微血管形成，降解血管内皮细胞的基质，削弱血管的屏障作用，致使新生血管基底膜缺损加重，更利于癌细胞的进入，为肿瘤的转移创造条件。多种因素影响VEGF表达，包括细胞因子等。多种细胞因子之间存在信息交流（crosstalk）现象，直接或间接参与调节了VEGF基因的转录和翻译。VEGF表达的调节是一个非常复杂的过程，它可以被多种因素在不同水平调节，包括在基因转录、mRNA稳定以及mRNA转录水平的调节。许多血管生成因子本身就是有力的VEGF基因表达的诱导剂，这些因子很可能是通过诱导或放大VEGF的合成来发挥它们的促进血管生成作用的。肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor，HGF）是由基质细胞产生的一种多功能生长因子，它在正常或肿瘤细胞中主要以旁分泌方式发挥作用。HGF主要通过激活细胞表面的受体c-met的酪氨酸激酶磷酸化发挥生物学作用。HGF不仅在正常肝细胞增值过程中起着重要作用，还具有促进肝癌细胞增值、细胞运动及血管形成等多种功能。HGF和VEGF对血管内皮细胞增殖和毛细血管形成均有促进作用。HGF可以在多种细胞中表现出强有力的上调VEGF表达作用。并且HGF和VEGF具有协同作用。HGF与VEGF之间相互作用的分子机制尚不清楚，理解这一机制，可以为控制肝癌的血管形成提供新的理论依据及治疗策略。MHCC97H是从MHCC97细胞系中进一步分离出的具有高转移潜能的肝癌细胞株。该细胞株来源于肝癌患者，其生物学行为接近临床实际情况，因此，我们选用该细胞株作为研究HGF诱导VEGF的表达的分子机制的平台。第一部分肝癌MHCC97H细胞中肝细胞生长因子对VEGFmRNA、蛋白质表达及其转录因子Sp1磷酸化的影响一、HGF对MHCC97H细胞VEGF mRNA的影响：HGF主要通过激活细胞表面的受体c-Met的酪氨酸激酶磷酸化发挥生物学作用。给与不同浓度HGF培养16h后，随HGF刺激浓度增加VEGF mRNA表达量增加。分别给予20ng／ml和40ng／ml HGF作用后HGF组VEGF mRNA的表达量（1.04±0.16及1.20±0.18）升高，与对照组（0.95±0.12）比较无统计学意义（P=0.089及0.17）。60ng／ml、80ng／ml HGF作用后HGF组VEGF mRNA的表达量分别为（1.40±0.21及2.68±0.43），均较对照组（0.95±0.12）明显升高（P=0.026及0.0034），但60ng／ml与80ng／ml浓度HGF刺激MHCC97H后无的VEGF mRNA表达无统计学差异（P=0.19）。二、Western Blot蛋白印迹法分析不同浓度HGF对MHCC97H细胞VEGF蛋白表达的影响：在正常培养的肝癌MHCC97H细胞中检测出有VEGF蛋白的表达，用20ng／ml、40ng／ml、60ng／ml、80ng／ml不同浓度HGF培养MHCC97H细胞24h后，VEGF蛋白表达量随HGF刺激浓度增加相应增加。其中20ng／ml、40ng／ml浓度的HGF作用后VEGF蛋白的表达量升高，与对照组比较无统计学意义，P值分别为0.15、0.11。60ng／ml、80ng／ml浓度的HGF孵育MHCC97H细胞后，VEGF蛋白质的表达量分别为（1.64±0.16；2.15±0.21），均较对照组明显升高（P=0.013及0.0041），但两者之间无统计学差异（P=0.24）。提示HGF可以诱导MHCC97H细胞VEGF mRNA及随后的蛋白质的表达。三、HGF对肝癌MHCC97H细胞转录因子Sp1蛋白质水平的影响：加入HGF于MHCC97H肝癌细胞中，使其终浓度为60ng／ml，分别培养5、10、15、30、60min后，以免疫沉淀法检测细胞核内转录因子Sp1的蛋白质水平，结果发现Sp1蛋白质水平不随HGF干预时间发生变化，60ng／ml HGF孵育5、10、15、30、60min后，Sp1蛋白的浓度与对照组没有显著区别（P＞0.05）。四、HGF对肝癌MHCC97H细胞磷酸化Sp1水平的影响：用免疫沉淀法进一步分析HGF刺激后细胞核内磷酸化Sp1水平的变化时发现，60ng／ml HGF培养MHCC97H肝癌细胞15min后，磷酸化Sp1水平开始明显升高，达到1.52±0.30，与对照组（0.73±0.05）比较有显著差异，P=0.012，且不随时间进一步提高。五、Sp抑制剂光辉霉素对VEGF表达的影响：预先给予MHCC97H细胞Sp1的抑制剂光辉霉素（150nM）孵育1h后，再给与HGF 60ng／ml，观察VEGF mRNA及蛋白质表达的情况。结果发现给与光辉霉素后，HGF诱导的VEGF mRNA较HGF组明显下降，随后的VEGF蛋白质亦受到抑制，提示Sp1参与了HGF诱导的MHCC97H细胞VEGF表达的过程。第二部分蛋白激酶C（PKCs）在HGF诱导VEGF蛋白表达过程中的作用细胞受到HGF刺激后的一系列反应中，涉及到功能性蛋白激酶C的激活。PKC是丝氨酸／苏氨酸激酶家族成员，根据基本结构和激活方式的不同，分为三个亚族：cPKC、nPKC、aPKC。PKC是细胞内信号转导通路的重要组成成分。肿瘤的血管形成有赖于PKC的激活。一、PKC在HGF诱导的VEGF蛋白表达过程中的作用：我们首先用广谱的PKC抑制剂Ro31-8220（10μM）检测HGF诱导MHCC97H细胞VEGF表达过程中PKC的参与情况。与HGF组相比，广谱PKC抑制剂Ro31-8220能够完全抑制HGF所诱导的蛋白质升高。二、不同类型PKC在HGF诱导肝癌MHCC97H细胞VEGF表达过程中的作用：我们用高度特异性cPKC抑制剂calphostin C、选择性cPKC及nPKC的抑制剂BIM孵育MHCC97H细胞1h后加入HGF60 ng／ml，用Western blot法检测PKCβ，PKCδ磷酸化水平，发现HGF可以提高PKCβ，PKCδ的磷酸化水平，Cal C及BIM可以抑制两者的磷酸化。三、BIM对VEGF mRNA及蛋白质表达的影响：在BIM预先处理组，用RT-PCR及Western blot分别检测MHCC97H细胞16hVEGF mRNA及24hVEGF蛋白质水平，结果发现BIM不能抑制HGF诱导的VEGF mRNA及其随后的蛋白质表达，与HGF组无显著性差异。四、非典型PKC中PKCζ对HGF诱导的VEGF表达中的作用：我们已经除外了cPKC及nPKC在HGF诱导的MHCC97H细胞VEGF表达过程中的作用，因此，我们主要分析aPKC，特别是PKCζ在这一过程中的作用。用PKCζ特异性抑制蛋白ζ-PS（100μM）预先处理MHCC97H细胞1h，再加入60ng／ml的HGF孵育15分钟后，用仅针对磷酸化PKCζ的特异性抗体的免疫沉淀法检测p-PKCζ水平以及Western blot检测24b后VEGF蛋白质水平变化。结果发现，HGF促进PKCζ磷酸化水平但不提高总PKCζ水平。ζ-PS能够抑制HGF这种促进作用。第三部分磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）／蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（Akt）途径在HGF诱导MHCC97H细胞VEGF蛋白表达过程中的作用PI3K在多种细胞中广泛表达，可以被多数受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体及与非受体型酪氨酸激酶相关的受体激活。Akt是一种蛋白丝氨酸苏氨酸激酶，是PI3K激活后的直接下游效应分子之一，因此也是信号转导深入研究的焦点。为研究MHCC97H细胞内HGF对VEGF表达及激活Akt蛋白过程中信号分子的变化，我们分析了PI3K选择性抑制剂LY294002、wortmannin在MHCC97H细胞中对HGF诱导的VEGF mRNA及蛋白质以及Akt磷酸化的影响。预先用LY294002、wortmannin处理1h，然后给予HGF60ng／ml分别孵育15min，16h及24h，用仅能识别Akt特异性Ser473及Thr308位点磷酸化的特异性抗体以及Western blot法分析Akt及p-Akt的水平变化，结果发现LY294002、wortmannin均可以有效阻断HGF诱导的Akt的磷酸化。RT-PCR结果显示预先给予的wortmannin能够抑制HGF孵育MHCC97H细胞16小时后的VEGFmRNA及24小时后的VEGF蛋白质的升高。第四部分HGF诱导MHCC97H细胞VEGF表达过程中信号分子之间相互关系的研究Sp1是一个高度糖基化和磷酸化的蛋白。Sp1可以被多种细胞激酶磷酸化，包括DNA依赖蛋白激酶、酪蛋白激酶Ⅱ以及PKCζ。近年不少文献显示PKC-ζ是PI3K的下游效应蛋白。我们前面的研究表明，HGF刺激MHCC97H细胞后可以引发多种信号级联反应，包括转录因子Sp1、PKCζ以及丝氨酸／苏氨酸激酶Akt。本实验，我们利用各分子的化学性阻断剂及PKCζ假性底物抑制蛋白（ζ-PS）分析HGF诱导VEGF表达过程的信号分子之间的关系。我们分别预先给予MHCC97H细胞wortmannin、ζ-PS孵育1小时后加入HGF60ng／ml，分析HGF孵育15min时的各信号分子变化情况。免疫沉淀法检测Sp1、PKCζ磷酸化水平，Western blot分析磷酸化Akt水平。我们发现，PI3K的抑制剂wortmannin能够抑制HGF诱导的MHCC97H肝癌细胞PKCζ、Sp1磷酸化，PKCζ假性底物抑制剂ζ-PS能够有效抑制Sp1磷酸化，但不能抑制Akt^Ser473的磷酸化。综合以上实验结果，我们发现HGF诱导MHCC97H细胞VEGF表达过程中涉及转录因子Sp1、PKCζ以及PI3K／Akt多种信号分子，信号传递路径依次为细胞内PI3K／Akt路径磷酸化而被激活，进而活化PKCζ，活化的PKCζ将信号传递给核内转录因子Sp1，使其磷酸化水平提高，进而促进了VEGF的转录及其随后的蛋白质合成。多种抑制剂以及PKCζ假性底物抑制蛋白ζ-PS可以阻抑这一信号传递过程，可能成为抑制肝癌细胞血管形成的潜在的研究目标。