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第一部分RNA干扰下调上皮源性肿瘤细胞表皮生长因子受体表达及其生物学效应研究【目的】表皮生长因子受体在多种上皮源性肿瘤中过表达，其过度表达和／或激活与肿瘤患者生存期短、预后差、放化疗敏感性下降相关，是目前公认的肿瘤生物治疗的重要靶点。本研究拟探讨靶向表皮生长因子受体的RNA干扰技术在不同类型上皮源性肿瘤细胞A431、HeLa、SPC-A-1中的RNA干扰效应及其生物学效应。【方法】化学合成靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA，以阳离子脂质体Lipofectamine2000为载体转染A431、HeLa、SPC-A-1细胞，通过免疫荧光染色、流式细胞仪和定量RT-PCR检测表皮生长因子受体表达；通过集落形成实验观察细胞集落形成能力，采用MTT法测定细胞增殖活力；分析不同类型上皮源性肿瘤细胞的RNA干扰效应以及表皮生长因子受体下调后的生物学效应。【结果】1)免疫荧光染色观察、流式细胞仪检测、定量RT-PCR得到了完全一致的结果：A431细胞、HeLa细胞和SPC-A-1细胞存在表皮生长因子受体高表达，且A431细胞表皮生长因子受体的表达，尤其是其mRNA表达，强于HeLa细胞和SPC-A-1细胞。2)通过免疫荧光染色观察，可见转染靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA后第1天，3种肿瘤细胞的表皮生长因子受体表达出现下降，转染后第2天表达几乎消失；无关序列的小干扰RNA对细胞表皮生长因子受体的表达无影响。3)转染靶向表皮生长因子受体的小干扰RNA后，3种肿瘤细胞的表皮生长因子受体表达均明显下调。在A431细胞，其mRNA水平下调73.9％，蛋白水平下调77.0％。在HeLa和SPC-A-1细胞，mRNA水平的下调分别为44.6％和57.7％，蛋白水平分别下调61.3％和65.2％。4)表皮生长因子受体下调后细胞集落形成能力均出现抑制，A431、HeLa和SPC-A-1的集落形成抑制率分别为27.2％、53.9％和59.1％。5)采用MTT法测定细胞活力后发现，RNA干扰对A431细胞、HeLa细胞、SPC-A-1细胞活力的抑制呈现明显的时间效应关系。转染后第1天即可观察到细胞活力的抑制。A431细胞活力的低谷出现于转染后第1天，细胞活力下降31.7％。HeLa细胞和SPC-A-1细胞活力的抑制于转染后第2天最明显，细胞活力分别下降33.2％和31.3％。至转染后第3～4天小干扰RNA对细胞活力的抑制效应减退。这与小干扰RNA下调靶基因表达的的时间效应关系基本相符。[结论]我们的研究证实靶向表皮生长因子受体的RNA干扰技术可在不同组织来源、不同病理类型、不同表皮生长因子受体表达水平的上皮源性肿瘤细胞中，下调表皮生长因子受体表达，抑制细胞增殖活力和集落形成能力；为开发基于RNA干扰技术、以表皮生长因子受体为靶向的广谱抗肿瘤药物提供了依据。第二部分RNA干扰下调肺腺癌细胞表皮生长因子受体表达后抑制细胞增殖的机制研究[目的]本研究采用靶向表皮生长因子受体的短发夹RNA质粒表达载体，探讨快速增殖的肿瘤细胞中RNA干扰下调表皮生长因子受体表达后抑制细胞增殖的机制。[方法]本研究采用美国Ambion公司pSilencer2.1-U6 neo载体，根据设计的小干扰RNA序列合成DNA表达模板，将其插入pSilencer2.1-U6 neo中，构建靶向表皮生长因子受体的短发夹RNA质粒表达载体。使用脂质体转染法，将此质粒转染入人肺腺癌细胞SPC-A-1，以流式细胞仪测定细胞周期，免疫印迹检测表皮生长因子受体表达下调后，其下游主要信号通路蛋白P13K、AKT和ERK1／2以及细胞周期蛋白cyclin D1、p21和p16的表达变化及时间效应关系。[结果]1)采用免疫印迹法检测发现：SPC-A-1细胞的表皮生长因子受体蛋白量从转染后第2天起即开始下降；至转染后第6天，抑制率达89.9％；第8天起抑制效应开始减退，但至转染后第10天，抑制率仍可达77.5％。2)细胞周期测定可见SPC-A-1细胞从转染后第2天起出现细胞周期的改变。G0／G1期比例升高，S期比例下降。至转染后第10天，细胞周期的改变更显著，G0／G1期比例升高了21.4％，S期比例下降了23.1％，而G2／M期细胞比例无明显变化。3)RNA干扰下调SPC-A-1细胞的表皮生长因子受体表达后，其下游信号通路中的磷酸化P13K、AKT和ERK1／2的表达也相应地减少。并且，这些磷酸化信号通路蛋白明显下调的时点与shRNA表达质粒对EGFR产生的RNA干扰效应的时点相一致，即转染后第6天时EGFR和磷酸化的信号通路蛋白表达明显减少；但非磷酸化的ERK1／2、P13K和AKT蛋白表达量无变化。4)RNA干扰下调SPC-A-1细胞表皮生长因子受体后相应地出现了cyclin D1的表达减少，p21的表达增加，而p16的表达没有变化。[结论]短发夹RNA质粒表达载体在肺腺癌细胞SPC-A-1中成功地引发了序列特异性的RNA干扰效应，且较化学合成的小干扰RNA效应持久、效率更高。RNA干扰下调表皮生长因子受体表达后阻断其下游信号蛋白包括PI3K、AKT和ERK的磷酸化，下调cyclin D1的表达，使p21表达增加，在G1／S期的转换点阻滞细胞周期，最终产生抑制肿瘤细胞增殖的生物学效应。