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研究背景卵巢癌（Ovarian Cancer,OC）是女性生殖系统中的第三大恶性肿瘤,却是死亡率最高的妇科癌症。由于其发病隐匿,当出现症状而就诊时已发生转移,其五年生存率仅为30%-40%。上皮性卵巢癌占OC的95%,而此类型卵巢癌易发生转移。已有报道发现,卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone,FSH）与上皮性卵巢癌的形成密切相关。但FSH直接影响OC发生发展的作用机制尚未明确,为进一步研究FSH在OC中的作用,寻找新的分子靶点,探索新的分子作用机制,对临床诊断和治疗OC提供更多的理论基础和实验依据。迄今为止,OC的发病机制包括持续反复排卵假说,促性腺激素学说和性激素-类固醇激素假说等,但其具体作用机制尚未阐明。OC发病风险随着年龄增长而增加,其发病高峰主要为女性绝经后期,绝经后期的女性体内雌激素水平下降,FSH和LH水平急剧升高并一直维持在高水平状态。高水平FSH与卵巢上皮细胞的癌变密切相关,FSH亦可促进卵巢肿瘤细胞侵袭及迁移能力。但是,FSH影响卵巢癌的侵袭和迁移的具体机制亦未阐明。上皮细胞-间充质细胞转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）,是指上皮细胞通过特定转化程序转化为具有间质细胞特性的生物学过程。EMT过程,是参与肿瘤侵袭和转移的关键步骤,其激活状态预示着肿瘤细胞向外扩张的能力增强,同时也代表疾病的进展或预后不良。EMT受到包括转录调控、RNA可变剪接、翻译或翻译后调控等多种因素共同调控,其中最经典的调控因素为EMT转录因子。Snail属于锌指蛋白转录因子家族的成员,在EMT过程中发挥关键作用。有研究表明,Snail蛋白上调参与多种肿瘤的进展。新近的研究证实了卵巢癌中Snail的表达与E-cadherin表达负相关,与卵巢癌进展及不良预后正相关。因此,本课题将以Snail为切入点,研究FSH通过促进EMT发生参与卵巢癌进展的分子机制。蛋白质的表达,受到包括转录、转录后调控、蛋白修饰等多个层面的调控。而FSH转录后调控的作用机制尚未报道。迄今为止,已鉴定出100多种转录后修饰方式,而N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine,m6A甲基化）是最普遍的修饰之一,它是指mRNA腺苷碱基上的N6位发生甲基化,这种修饰方式影响mRNA稳定性、mRNA前体剪切、多腺苷酸化、mRNA运输与翻译起始等。m6A是由甲基化转移酶（Writers）、去甲基化酶（Erasers）和阅读蛋白（Readers）等共同调控,广泛参与调节细胞的自我更新、分化、侵袭和凋亡等。研究发现在卵巢癌中,METTL3提高AXL mRNA的翻译和上皮-间充质转换,从而促进卵巢肿瘤的生长和侵袭。因此,FSH是否通过m6A修饰促进Snail表达进而激活卵巢癌EMT,这是我们即将探究的问题。研究目的探究FSH通过上调ALKBH5蛋白表达降低Snail m6A水平诱导上皮性卵巢癌细胞发生EMT的调控机制,阐明Snail mRNA甲基化水平介导FSH诱导上皮性卵巢癌发生EMT的重要作用。方法和结果第一部分:FSH上调Snail蛋白表达促上皮性卵巢癌细胞发展的作用机制不同条件下,FSH处理上皮性卵巢癌细胞（SK-OV3）,探究Snail介导FSH促上皮性卵巢癌细胞诱导EMT发生、细胞增殖、迁移和侵袭能力中的作用。1.1 FSH影响上皮性卵巢癌细胞EMT分子的表达FSH可浓度依赖性（5mIU、10mIU、50mIU、75mIU、100mIU）和时间依赖性（8h、16h、24h、32h、48h）上调N-cadherin mRNA水平（P<0.05）和蛋白表达,下调E-cadherin mRNA水平（P<0.05）和蛋白表达。1.2 FSH促上皮性卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭FSH（75mIU,48h）促进上皮性卵巢癌细胞增殖（P<0.001）、迁移（P<0.01）和侵袭能力（P<0.001）。1.3 Snail介导FSH促上皮性卵巢癌细胞发生EMT、增殖、迁移和侵袭FSH可浓度依赖性（5mIU、10mIU、50mIU、75mIU、100mIU）和时间依赖性（8h、16h、24h、32h、48h）上调Snail蛋白水平,但对其mRNA水平无明显影响（P>0.05）。同时FSH对其他EMT转录因子Slug、Zeb1、Zeb2蛋白和mRNA水平无明显影响（P>0.05）。基因沉默技术降低Snail蛋白表达,可明显抑制FSH上调上皮性卵巢癌细胞诱导EMT发生、细胞增殖（P<0.001）、迁移（P<0.001）和侵袭能力（P<0.001）的效应。第二部分:ALKBH5介导FSH上调上皮性卵巢癌细胞中的Snail蛋白表达的作用机制2.1 FSH降低Snail mRNA m6A水平采用me RIP-RT-PCR实验检测Snail mRNA m6A水平。结果显示:FSH（75mIU,48h）可降低Snail mRNA m6A水平（P<0.05）。2.2 FSH上调上皮性卵巢癌细胞中ALKBH5蛋白和mRNA水平FSH可浓度依赖性（5mIU、10mIU、50mIU、75mIU、100mIU）和时间依赖性（8h、16h、24h、32h、48h）上调ALKBH5蛋白和mRNA水平（P<0.05）,同时FSH对FTO、METTL3及METTL14蛋白和mRNA水平无明显影响（P>0.05）。2.3 ALKBH5降低Snail mRNA m6A水平降低ALKBH5表达,可明显上调Snail mRNA m6A水平（P<0.01）。2.4 ALKBH5介导FSH通过增强Snail mRNA稳定性上调Snail蛋白表达2.4.1敲低ALKBH5表达能抑制Snail蛋白的表达,抑制EMT进程敲低ALKBH5蛋白表达,可明显抑制FSH诱导Snail和N-cadherin蛋白表达,进一步促进FSH诱导E-cadherin蛋白表达,同时可显著抑制FSH促进上皮性卵巢癌细胞的增殖（P<0.001）、迁移（P<0.01）和侵袭能力（P<0.001）。2.4.2 ALKBH5通过增强Snail mRNA稳定性而上调Snail蛋白表达在上皮性卵巢癌细胞中分别转染空载慢病毒NC shRNA或ALKBH5 shRNA,分别给予Act-D或CHX处理2h、4h、6h、8h、10h,结果显示:降低ALKBH5可延长前体Snail和成熟体Snail半衰期,表明ALKBH5在维持Snail mRNA稳定性发挥重要作用。而降低ALKBH5不能影响Snail蛋白质半衰期,表明ALKBH5不能影响Snail蛋白质稳定性。2.4.3过表达ALKBH5表达能促进Snail蛋白的表达,促进EMT进程过表达ALKBH5蛋白,可明显上调FSH诱导Snail和N-cadherin蛋白表达,抑制FSH诱导E-cadherin蛋白表达,同时可显著促进FSH促进上皮性卵巢癌细胞的增殖（P<0.001）、迁移（P<0.001）和侵袭能力（P<0.001）。2.5 ALKBH5/Snail介导FSH促上皮性卵巢癌细胞发生EMT、细胞增殖、迁移和侵袭能力降低ALKBH5蛋白表达,可显著抑制FSH促上皮性卵巢癌细胞发生EMT、细胞增殖（P<0.001）、迁移（P<0.001）和侵袭能力（P<0.001）的效应;而回补Snail蛋白后,可显著逆转上述作用（P<0.001）。2.6 FSH经典信号分子PKA、PI3K/AKT、CREB参与FSH上调ALKBH5蛋白表达2.6.1 PKA、PI3K/AKT、CREB信号通路与FSH上调ALKBH5表达有关FSH上调ALKBH5和Snail的作用可被CREB抑制剂666-15、PKA抑制剂H89和PI3K抑制剂Wortmannin抑制,且H89和Wortmannin能抑制CREB表达,而666-15不能抑制AKT表达,表明PKA和PI3K-AKT为CREB通路的上游。2.6.2 FSH上调上皮性卵巢癌细胞p-AKT、p-CREB表达FSH可浓度依赖性（5mIU、10mIU、50mIU、75mIU、100mIU）和时间依赖性（8h、16h、24h、32h、48h）上调p-CREB和p-AKT蛋白水平,但对总CREB和AKT蛋白水平无明显影响。2.6.3 CREB促进ALKBH5转录活性构建空载及CREB过表达质粒、ALKBH5荧光素酶报告基因质粒,检测CREB对ALKBH5转录活性影响。结果表明CREB与ALKBH5启动子区域结合,促进ALKBH5转录。结论1.Snail蛋白在FSH促上皮性卵巢癌细胞诱导EMT中发挥关键作用。2.FSH通过上调ALKBH5蛋白表达促进Snail mRNA m6A去甲基化修饰,上调Snail蛋白表达,诱导上皮性卵巢癌细胞发生EMT,进而促进癌细胞增殖、侵袭和迁移。