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天山樱桃、野生樱桃李、野生欧洲李是新疆伊犁地区珍贵的野生果树资源,对维持和改善当地的生态体系具有重要作用。目前三种果树面临着生态环境脆弱及人为破坏严峻的双重考验,本研究拟采用EST-SSR分子标记法对这些野生资源进行保护。通过查找三种果树的EST序列,设计属于三种果树的特异性引物,筛选最佳SSR-PCR反应体系,验证引物的通用性,将所开发的引物用于今后对三种野生果树的基因组学研究中。主要研究结果如下:(1)NCBI公共数据库中天山樱桃EST序列共计111850条,含SSR的EST序列共8288条,占EST总数的7.41%。其中二核苷酸占主导地位,CT和TC是天山樱桃碱基重复的主要类型,占核苷酸总数的40.17%。试验中选择并合成了30对引物,对30对引物进行检测,有效扩增率达70%。(2)NCBI公共数据库中樱桃李EST序列共计347条,含SSR的EST序列共270条,占EST总数的77.81%。在樱桃李有限的序列中仅存在三种类型的重复基元,SSR类型并不丰富,但SSR出现频率在三种果树中最高。重复基元以二、三核苷酸为主体,二核苷酸重复中SSR数目最多,占SSR总数的87.40%。试验中合成了30对可用引物,有效扩增率为66.67%。(3)NCBI数据库中欧洲李序列仅有54条,不足以设计出引物,因此用李属及其近缘物种黑刺李、李、乌荆李、杏李等植物的EST序列进行引物设计。在4379条EST序列中查找到692个SSR,占EST序列总数的15.80%。其中二、三核苷酸重复为主体,二核苷酸数目最多,占SSR总数的82.50%,三核苷酸重复基元类型最丰富。试验共合成了54对引物,有效扩增率为64.82%。(4)本研究针对天山樱桃、樱桃李和欧洲李共设计合成了114对引物,大多数引物在56℃时能扩增出清晰谱带,只有天山樱桃引物在此温度下扩增谱带较少,于是对不能扩增出谱带的天山樱桃引物进行退火温度梯度筛选,共设计了12个温度梯度,温度区间为48~66℃,分析发现大部分引物退火温度集中在55.9~60.3℃之间。(5)本研究从稳定性与经济性出发,建立优化了的SSR-PCR反应体系,筛选出了dNTPs、引物、Taq酶和模板DNA的优势组合。20μL反应体系为:dNTP 0.2 mmol/L、引物0.4μmol/L、Taq酶0.75 U、模板DNA 60 ng。SSR扩增程序为:95℃预变性5 min;30个循环(95℃变性30 s,56℃退火30 s,72℃延伸45 s);72℃延伸10 min。试验证实该体系稳定可靠。(6)本研究验证了天山樱桃,樱桃李和欧洲李EST-SSR引物具有一定通用性,且同属植物间通用性高于跨属植物间。樱桃李引物在欧洲李中扩增率为90%,表明了樱桃李和欧洲李基因组差异较小。