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磷脂酶D（phospholipase D,PLD）广泛存在于细菌、真菌、植物及动物组织细胞中，作用于膜脂质的磷脂酰胆碱（phosphatidylcholine, PC），使其水解生成磷脂酸（phosphatidic acid, PA）和胆碱。PC是膜脂中含量最高的脂质，约占膜脂总量的50％。PA在磷脂酸磷脂酶（phosphatidic acid phosphohydrolase, PAP）的作用下生成二酯酰甘油（diacylglycerol, DAG），在磷脂酶A2作用下生成溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid, LPA）。PA、DAG、LPA三者均为细胞内重要的第二信使，PLD通过这些第二信使对众多细胞过程产生影响，其中涉及细胞的有丝分裂、分化增殖、胞膜的胞吞胞吐、中性粒细胞呼吸爆发、蛋白激酶C的激活等等。 1999年克隆了PLD的两种同功酶：PLD1和PLD2。PLD2含993个氨基酸，分子量为106KDa，是心肌的主要PLD，多数分布于心肌纤维膜。既往利用外源性PLD或短时程动物实验证实，PLD参与心肌收缩舒张、心肌肥厚、心肌缺血再灌注、血管舒缩、动脉粥样硬化等病理生理过程。但PLD长期在心肌过表达的后果及其信号传递机制不清楚。 本课题首次利用心脏特异性儿磷脂酶D2（hPLD2）转基因小鼠，研究hPLD2在体信 浙江大学博士学位论文一号传递机制，及长期在心肌过表达对心脏病理生理的影响。 研究方法：小鼠尾组织DNA的Southern杂交分析，确定hPo。转基因的存在。简述之，提取的DNA经BamHI酶切，凝胶电泳分离，探针杂交后显影。探针的上游引物；5’CCA TCC AAT GCC ACG CGT TC 3’，下游引物：5’xx＊n TAG TGG ATC CCAGCT TG 3’，模板：pBineJAllC－hPLD。－SV40。探针能与 2627hp、一M中两个片断杂交。体外荧光高效液相色谱法，检测心肌PLD活性。简述之，心肌匀浆并测定其蛋白质含量，样本蛋白与BODIPYwi脂酞胆碱在乙醇条件下，37C孵育30分钟，荧光高效液相色谱法检测 PLD产g酸。色谱柱 UChrosphere 100（SPop 250 X 4nun，荧光检测器激发波长’vsnm，发射波长slsnm。小鼠离体工作心脏模型，评价前负荷s－zsnnnHg、后负荷40－100 InmHg范围内，压力负荷在PLD信号传递机制中的作用；去甲肾上腺素1沪M至10加灌注心脏，评价去甲肾上腺素在PLD信号传递机制中的作用；全心缺血30分钟、再灌注1小时，评价PLD在心肌缺血再灌注损失中的作用。 研究结果： 1．1月石月3月龄野生型仰阻D／川。鼠，心肌PLD活性拥u为in．3上玉刀9，1旺．o6土24．97，106．73土11．4po，组间差别无显著意义o劝．05）；转基因型p LD广川鼠，心肌PLD活性舶u为413．85土42．80，1379．59土285．43，1248．05士167．92 pmollhllllg，显著高于同月龄野生型小鼠（P＜．05），而且3月、5月龄转基因型小鼠心肌PLD活性又显著高于1月龄转基因型小鼠（P 0．05），但3月与5月龄转基因型小鼠心肌PLD活性差别无显著意义O卜0．05)。 2．3月龄的转基因型小鼠与同月龄野生型小鼠相比，体重、心脏重量、胚骨长度以及心脏重量与体重之比、心脏重量与胚骨长度之比，差拐均无显著意义o劝．05)。5月龄的转基因型小鼠与同月龄野生则、鼠相比，体重、烃骨长度的差拐uXJih著意义o刃．05)，心脏重量以及心脏重量与体重之比、心脏重量与胚骨长度之比，差别均有显著意义（Pe．05），转基因型小鼠o脏重于野生型小鼠。 3．小鼠离体工作心脏模型，后负荷固定M前负荷5－25 IIunHg，前负荷固定 IM后负荷 40－100 t，每一个前后负荷条件下，包括心率（HR）、左室收 2 浙江大学博士学位论文缩压（LVPSy s）、左室压力最大上升腆（中M）、左室压力最小下降速率（加伯o山h）、平均主动脉压（API an）、平均主动脉流量（AF an）、冠状动脉流量（CR。w）和左房平均流量（ATFInea）在内的血流动力学指标，3月龄的转基因型小鼠与同月龄野生型小鼠相比，差别均无显著意义o刃．05)。 4．去甲肾上腺素 107MJ0’SM浓度范围内，引起IIR加快、LVPSys上升、dPldtmax增大和 dl)ldtlnin减小，对 APInAn、AFmall、CFloW和 AJTtlleall无影响。3月龄的转基因型小鼠与同月龄野生型小鼠相比，心率的差别无显著意义o卜0．05)，LVPSyS和dl)ldtlnax转基因型小鼠明显高于野生型小鼠（P＜．05），dl)ldtlnin转基因型小鼠明显低于野生型小鼠（P＜．05）。 5．心脏全心缺血30min，再灌注1／J＼时内，心功能（包括WS灿dPldtmax、dl）tw和 CO)的恢复在再灌注第 50Inin达最大值；冠状动脉流出液的乳酸脱氢酶 （LDH）的含量于再灌注第lImn达最大值，以后逐渐减少，再灌注第4OInn jdJI．．－动脉流出液中已无法检测出LDH。3月龄的转基因型小鼠与同月龄野生型小鼠相比，再灌注1小时内不同时点心功能的恢复、冠状动脉流出液LDH含量的差别均无显著意义（P＞．05）。 结论： 1．转基因型(llrAi／小鼠，心肌PLD体外活性显著增强。 2．过度表达hPLD23个月不导致心 巴厚、?