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研究背景:儿童原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)是由多种原因引起的肾小球基底膜通透性增高,导致血浆内大量蛋白质自尿液中流失,从而引起一系列病理和生理改变的的临床综合征。PNS占我国泌尿系统疾病住院患儿的首位。儿童PNS的病因以及发病机制目前仍未完全明确。既往认为儿童PNS的发生可能与菌群紊乱、免疫失调、炎症介质、遗传因素以及脂质代谢紊乱等多种因素有关。PNS肠道微生物菌群的变化可能会通过破坏肠上皮屏障并产生有毒副产物来改变肠道黏膜免疫系统而导致全身性免疫炎症。本研究旨在探究肠道菌群紊乱、炎症、Th17/Treg免疫失衡与儿童PNS的相关性,探讨其可能的发病机制,为儿童PNS的诊断、治疗寻找新的生物学靶点提供理论和实验依据。第一部分:肠道菌群紊乱与儿童PNS的炎症、Th17/Treg免疫失衡的相关性研究目的:探讨肠道菌群紊乱、炎症、Th17/Treg免疫失衡在儿童PNS中的情况,并分析与其的相关性以及可能的发病机制,以期为儿童PNS的诊断、治疗寻找新的生物学靶点。方法:1.本研究以苏州大学附属儿童医院2017.12～2018.12收治确诊的29例PNS患儿为研究对象,分为治疗前组(before treatment)和治疗后组(after treatment),另外本院同期15例健康体检儿童作为研究对照组(control)。2.收集治疗前、治疗后的29例PNS患儿和15例对照儿童自然排泄的粪便标本,基于 16S rRNA 技术,通过定量实时 PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法检测所有研究对象肠道益生菌乳酸杆菌、双歧杆菌和条件致病菌大肠杆菌的变化情况,并计算双歧杆菌/大肠杆菌(B/E)的比值。3.收集治疗前、治疗后的29名PNS患儿和15名对照儿童的空腹外周血,提取单个核细胞,应用流式细胞仪检测外周血单个核细胞中Th17、Treg细胞的比例。4.利用ELISA法检测血清中IL-17、IL-10、IL-6和TNF-α水平。5.利用Western blot检测外周血单个核细胞NF-κB的蛋白表达水平。6.应用单因素方差分析上述检测指标三组之间的差异性。7.应用Pearson相关分析上述相应指标间的相关性。结果:1.肠道菌群情况:与对照组相比,PNS患儿治疗前乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌的数量均下降(P<0.05),治疗后有所恢复,但未达到对照组正常水平(P<0.05);与对照组相比,PNS患儿治疗前B/E 比值降低(P<0.05),治疗后升高,并恢复至对照组正常水平(P>0.05)。2.外周血中Th17、Treg细胞的比例情况:与对照组相比,PNS患儿治疗前Th17细胞比例升高,Treg细胞比例降低(P<0.05)。治疗后,Th17细胞比例有所下降,但是仍高于对照组(P<0.05),Treg细胞比例增加,虽低于对照组,但组间差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,PNS患儿治疗前Th17/Treg细胞比值增加(P<0.05),治疗后Th17/Treg细胞比值恢复至对照组正常水平(P>0.05)。3.血清IL-17、IL-10、IL-6和TNF-α水平情况:与对照组相比,PNS患儿治疗前,血清IL-17、IL-6和TNF-α水平升高,治疗后有所下降,但是仍高于对照组(P<0.05);与对照组相比,PNS患儿治疗前血清IL-10水平下降,治疗后有所恢复,但未达到对照组正常水平(P<0.05)。4.外周血NF-κB蛋白水平情况:Western blot结果显示,与对照组比较,PNS患儿治疗前外周血NF-κB蛋白水平明显升高,治疗后有所恢复,但未达到对照组正常水平(P<0.05)。5.血清IL-17、IL-10水平与Th17、Treg细胞比例的相关性分析:Pearson相关分析显示,PNS患儿的血清IL-17水平与Th17细胞比例有相似的变化趋势,与Th17细胞的比例呈正相关(r=0.66,P<0.05);PNS患儿的血清IL-10水平与Treg细胞有相似的变化趋势,与Treg细胞比例呈正相关(r=0.52,P<0.05)。6.肠道菌群数量与Th17/Treg细胞比值的相关性分析:Pearson相关分析显示,PNS患儿乳酸杆菌、双歧杆菌和大肠杆菌数量与Th17/Treg细胞比值无相关性(P>0.05)。B/E比值与Th17/Treg细胞比值呈负相关性(r=-0.32,P<0.05)。7.肠道菌群数量与血清IL-17、IL-10、IL-6、TNF-α水平的相关性分析:Pearson相关分析显示,乳酸杆菌数量与IL-10水平呈正相关(r=0.34,P<0.05),与TNF-α水平呈负相关(r=-0.40,P<0.05);双歧杆菌数量与IL-10水平呈正相关(r=0.36,P<0.05),与 IL-17、IL-6 水平呈负相关(r=-0.35,P<0.05;r=-0.46,P<0.05);大肠杆菌数量与 IL-17、IL-10、IL-6、TNF-α水平均无相关性(P>0.05);B/E 比值与IL-17、IL-6水平呈负相关(r=-0.48,P<0.05;r=-0.32,P<0.05),与 IL-10 水平呈正相关(r=0.50,P<0.05)。结论:PNS患儿出现肠道菌群紊乱、外周血Th17/Treg细胞失衡、炎性介质升高,治疗后有所好转。肠道菌群紊乱可能参与了儿童PNS的发病机制,并与Th17/Treg细胞失衡和免疫炎症有关。第二部分:粪菌移植对阿霉素肾病SD幼鼠的治疗作用及机制研究目的:探讨粪菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)对阿霉素肾病SD幼鼠的治疗作用及可能相关机制,为调整肠道菌群紊乱作为儿童PNS治疗靶点的研究提供实验依据和理论依据。方法:1.雄性SD幼鼠,按数字随机表法分为对照(control)组、阿霉素肾病(adriamycin-induced nephropathy,AIN)组、FMT 组。2.AIN组、FMT组幼鼠尾静脉一次性注射阿霉素6.5 mg/kg,control组幼鼠尾静脉一次性注射等量生理盐水,一周后收集幼鼠24 h尿液检测尿蛋白,造模成功后用于后续实验。3.取正常健康幼鼠近端大肠内粪便制备FMT菌液,用灌胃针吸取0.2 ml制备好的菌液打入FMT组幼鼠胃内。control组、AIN组每只幼鼠每天注射0.2 ml无菌PBS(含20%甘油),连续7d。4.治疗7 d后,收集三组幼鼠24 h尿液检测尿蛋白。5.收集完24 h尿液后,各组幼鼠复合麻醉剂腹腔麻醉,开胸采集心脏血,提取单个核细胞,流式细胞仪检测Th17、Treg细胞的比例。ELISA法检测血清中IL-17、IL-10、IL-6和TNF-α的水平。6.血液样本采集好后,开腹取近端大肠。采集近端大肠内粪便样本,基于16S rRNA技术,利用qRT-PCR法检测肠道益生菌乳酸杆菌、双歧杆菌和条件致病菌大肠杆菌的变化情况,并计算双歧杆菌/大肠杆菌(B/E)的比值。7.取近端大肠组织,用无菌生理盐水反复冲洗干净后,提取组织蛋白,应用Western blot法检测肠组织中Jagged1、Hesl、ROR-yt和Foxp3蛋白水平。8.取肾脏,纵行剖开后福尔马林固定,以备HE染色。9.应用单因素方差分析上述三组检测指标之间的差异性。应用Pearson相关分析上述相应指标间的相关性。结果:1.幼鼠一般情况:一次性尾静脉注射阿霉素7 d后,AIN组、FMT组幼鼠納食减少,消瘦,有脱毛现象,被毛色泽差,活动减少,阴囊、四足水肿明显。检测24h尿蛋白定量显示,AIN组、FMT组幼鼠24 h尿蛋白分别为35.75±6.02 mg/24 h、37.34±3.39 mg/24 h,明显高于control组幼鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。2.幼鼠24 h尿蛋白定量情况:FMT处理7 d后,AIN组、FMT组幼鼠24 h尿蛋白量比造模成功时均有所升高,分别为62.16 ± 5.62 mg/24 h、44.73±9.91 mg/24 h,但FMT组幼鼠24h尿蛋白量明显低于AIN组,组间差异有统计学意义(P<0.05)。3.幼鼠肾脏病理改变情况:control组幼鼠肾脏可见正常肾小球;AIN组幼鼠肾脏可观察到肾病理损害,例如炎性细胞浸润、肾小管扩张或基底膜增厚、透明管型等;FMT组幼鼠肾脏也可观察到肾病理损害,但是炎性细胞浸润、肾小管扩张或基底膜增厚、透明管型等病变情况轻于AIN组。4.血中Th17、Treg细胞的比例情况:与control组相比,AIN组、FMT组幼鼠Th17细胞比例升高,但是FMT组Th17细胞比例明显低于AIN组(P<0.05);与control组相比,AIN组、FMT组幼鼠Treg细胞比例降低,但是FMT组Treg细胞比例明显高于AIN组(P<0.05);与control相比,AIN组、FMT组幼鼠Th17/Treg细胞比值增加,但是FMT组Th17/Treg细胞比值明显低于AIN组(P<0.05)。5.血清中 IL-17、IL-10、IL-6、TNF-α 水平情况:与 control 组相比,AIN 组、FMT组幼鼠血清中IL-17、IL-6和TNF-α水平升高,但是FMT组幼鼠血清IL-17、IL-6和TNF-α水平明显低于AIN组(P<0.05);与control组相比,AIN组、FMT组幼鼠血清中IL-10水平下降,但是FMT组幼鼠血清IL-10水平明显高于AIN组(P<0.05)。6.血清IL-17、IL-10水平与Th17、Treg细胞比例的相关性分析:Pearson相关分析显示,AIN幼鼠血清IL-17水平与Th17细胞比例有相似的变化趋势,与Th17细胞比例呈正相关(r=0.73,P<0.05);AIN幼鼠血清IL-10水平与Treg细胞有相似的变化趋势,与Treg细胞比例呈正相关(r=0.87,P<0.05)。7.幼鼠肠道菌群情况:AIN组肠道乳酸杆菌数量明显低于control组(P<0.05),FMT组幼鼠肠道乳酸杆菌数量略低于control组,但是差异无统计学意义(P>0.05),FMT组幼鼠肠道乳酸杆菌数量明显高于AIN组(P<0.05);与control组相比,AIN组、FMT组幼鼠肠道双歧杆菌数量明显降低(P<0.05),但是FMT组幼鼠肠道双歧杆菌数量明显高于AIN组(P<0.05);AIN组肠道大肠杆菌数量明显高于control组(P<0.05),FMT组幼鼠肠道大肠杆菌数量略高于control组,但是差异无统计学意义(P>0.05),FMT组幼鼠肠道大肠杆菌数量明显低于AIN组(P<0.05);与control组相比,AIN组、FMT组幼鼠B/E 比值明显降低,但是FMT组幼鼠B/E比值明显高于AIN 组(P<0.05)。8.肠道菌群数量与Th17/Treg细胞比值的相关性分析:Pearson相关分析显示,AIN幼鼠大肠杆菌数量与Th17/Treg细胞比值呈正相关(r=0.60,P<0.05);乳酸杆菌、双歧杆菌数量与Th17/Treg细胞比值呈负相关(r=-0.58,P<0.05;r=-0.41,P<0.05);B/E比值与Th17/Treg细胞比值呈负相关(r=-0.60,P<0.05)。9.肠道菌群数量与血清中IL-17、IL-10、IL-6、TNF-α水平相关性分析:Pearson相关分析显示,乳酸杆菌数量与IL-17、IL-6、TNF-α水平呈负相关(r=-0.70,P<0.05;r=-0.64,P<0.05;r=-0.52,P<0.05),与 IL-10 水平呈正相关(r=0.62,P<0.05);双歧杆菌数量与IL-10水平呈正相关(r=0.53,P<0.05);大肠杆菌数量与IL-17、IL-6、TNF-α水平呈正相关(r=0.55,P<0.05;r=0.76,P<0.05;r=0.51,P<0.05),与 IL-10 水平呈负相关(r=-0.61,P<0.05);B/E 比值与 IL-17、IL-6、TNF-α 水平呈负相关(r=-0.55,P<0.05;r=-0.65,P<0.05;r=-0.47,P<0.05),与 IL-10 水平呈正相关(r=0.67,P<0.05)。10.幼鼠大肠组织中Jagged1、Hesl、ROR-γt和Foxp3蛋白水平情况:与control组相比,AIN组、FMT组幼鼠大肠组织中Jaggedl、Hesl、ROR-yt蛋白相对表达量升高,但是FMT组幼鼠大肠组织中Jagged1、Hesl、ROR-γt蛋白相对表达量明显低于AIN组(P<0.05);与control组相比,AIN组、FMT组幼鼠大肠组织中Foxp3蛋白相对表达量降低,但是FMT组幼鼠大肠组织中Foxp3蛋白相对表达量明显高于AIN 组(P<0.05)。结论:FMT治疗阿霉素肾病SD幼鼠,可以改善幼鼠蛋白尿情况,减轻肾脏病理改变,这与FMT治疗后减轻幼鼠肠道菌群紊乱、Th17/Treg细胞失衡、炎性介质升高等情况有关。FMT治疗阿霉素肾病SD幼鼠的机制可能与Notch信号有关。FMT可能成为PNS治疗的新的生物学方法。