西番莲(Passiflora edulis Sims)染色体微分离与单染色体DNA文库的构建

来源 :福建农林大学 | 被引量 : 10次 | 上传用户:yulaohuazi
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紫果西番莲(Passiflora edulis Sims)为西番莲科西番莲属的多年生常绿攀缘性藤本果树,是热带、亚热带重要果树之一。目前西番莲研究多集中于栽培引种、果实加工、进化关系等方面,对西番莲的遗传背景研究很少,基因连锁遗传图谱的研究更是缺乏,育种工作只能通过传统方式开展,效率不高。利用日益成熟的染色体显微分离技术,分离西番莲单染色体,进行PCR扩增,建立单染色体DNA文库,进而运用RAPD和AFLP技术,可以较快地从文库中筛选特异性分子标记,寻找与目的基因紧密连锁的探针,进行精细的分子作图,为西番莲的分子育种奠定理论基础。本研究以紫果西番莲的实生种子为材料,探索了西番莲的细胞学制片技术并进行了核型分析,分离了随体染色体(第4染色体)建立了单染色体DNA文库,并利用AFLP寻找染色体特异性标记。主要结果和结论如下:1.不同浸种时间及光照对西番莲种子萌发的影响通过对西番莲种子的浸种研究发现,适当的浸种可以提高种子的发芽率,使发芽集中。浸种3d内,发芽率与发芽势都比未浸种的高,其中以浸种1d效果最好,3d以后,发芽率和发芽势都低于未浸种处理,随着浸种时间的延长,其发芽率和发芽势逐渐下降。黑暗环境有利于西番莲种子的萌发。2.不同预处理对西番莲根尖细胞有丝分裂中期分裂相形态的影响不同化学药剂对西番莲根尖细胞进行处理的结果表明,采用8-羟基喹啉(0.002mol·L-1)处理2.5h效果最好,压片后染色体分散好,着丝点比较清晰,随体明显,便于染色体的辨认。3.西番莲核型研究西番莲核型的研究结果表明,染色体数目为2n=18,第1和第8对为近中部着丝粒染色体,其余7对均为中部着丝粒染色体,第4对染色体带有随体,其核型公式为2n=2x=18=14m(2sat)+4sm。4.西番莲随体染色体DNA文库的构建用玻璃针显微分离出西番莲带随体染色体,经LA—PCR扩增得到210~1100 bp的DNA片段。经Southern杂交表明,扩增片段与西番莲基因组DNA之间有同源性,从而证明西番莲带随体染色体DNA已经被成功扩增。将扩增产物克隆到pUCM—T载体中,约获得1.17×105个克隆,酶切鉴定插入片段大小为300~2000bp。5.利用AFLP技术筛选染色体特异性标记将LA—PCR与AFLP技术结合,对分离出的单染色体PCR产物进行AFLP分析,发现各染色体间存在明显的多态性,同时发现一对引物组合(H+L)能稳定的扩增出两条随体染色体的3条相近条带。
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