背景胶质瘤是最常见的中枢神经系统(central nerve system,CNS)原发性的恶性肿瘤,其复发率高且预后差,目前国内外脑胶质瘤的治疗主要以手术为基础,联合放、化疗等综合治疗。但无法解决复发率高问题,尚需探讨新治疗途径。胶质瘤干细胞(glioma stem cell,GSC)是指胶质瘤细胞中有自我更新,无限增殖及多向分化的能力的一群细胞,而且即使同一种胶质瘤中,GSC也有多种表型,可能正是因为以上特性,GSC是胶质瘤进展和复发的起源。肿瘤免疫治疗主要包括免疫细胞疫苗、肽类疫苗、放射免疫疗法、细胞因子疗法、免疫检查点阻断剂治疗等。树突状细胞(dendritic cell,DC)是免疫细胞中功能最强的专职抗原呈递细胞。以胶质瘤细胞抗原负载DC制备的疫苗,在很多研究中提示有杀伤肿瘤效果。本课题组在前期工作中,尝试了针对GSC为靶向的同源胶质瘤免疫治疗,显示出有效性和安全性,疗效乐观。为了更深入验证本疫苗的安全性,本研究主要从以下方面关注了 GSC凋亡抗原负载DC疫苗的安全性:一是制备疫苗过程中会否有GSC残留于DC疫苗中引起成瘤性;二是DC疫苗会否因为提呈了 GSC凋亡抗原中的正常抗原,引起T细胞杀伤正常细胞,如神经干细胞(neural stem cell,NSC)、星形胶质细胞,二者与GSC有共同抗原。方法本研究主要分三个部分:(1)GSC的分选及GSC凋亡抗原获取。GL261小鼠胶质瘤细胞系作为胶质瘤细胞来源,通过磁珠分选出CD133+GSC,并流式检测GSC纯度;然后通过凋亡诱导剂诱导GSC凋亡,获取GSC凋亡抗原,并行流式检测GSC凋亡抗原的比例。(2)DC及T细胞培养、鉴定和T细胞杀伤实验。提取C57BL/6小鼠(与GL261小鼠同源)的骨髓细胞原代培养获得DC,于培养第5天将GSC凋亡抗原(第一部分所制备)加入到DC培养体系中,即抗原负载制备DC疫苗,并行流式检测DC疫苗成熟情况及细胞纯度;提取C57BL/6小鼠脾脏细胞,通过磁珠分选获得CD3+T细胞,并行流式检测T细胞纯度;将DC与T细胞共培养24h,进行抗原提呈及激活T细胞,然后将T细胞与NSC、星形胶质细胞共培养6h,并通过乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测NSC及星形胶质细胞有无被T细胞杀伤。(3)DC疫苗成瘤性及免疫安全性相关实验。GSC-DC疫苗制备后(第二部分),经过流式分选纯化(即除去残留的GSC),然后在裸鼠皮下注射GSC-DC疫苗观察成瘤情况,阳性对照组皮下注射GSC,阴性对照组皮下注射未处理过的DC,1个月后对比各组成瘤情况;在C57BL/6小鼠尾静脉注射DC疫苗,阳性对照组尾静脉注射脂多糖(lactic dehydrogenase,LPS)刺激过的DC,阴性对照组尾静脉注射未处理过的DC,2周后取血检查血常规和肝肾功能,观察有无白细胞、淋巴细胞等免疫细胞异常,及有无肝肾损害;同样2周后取脑组织行病理检查,观察有无异常免疫炎症细胞浸润脑组织,反映有无自身免疫发生。结果(1)GSC流式检测纯度达到89.5%,活力良好;诱导凋亡后GSC凋亡抗原比例达到98.6%;(2)凋亡抗原负载DC后促进了 DC成熟,流式分选后DC纯度达到96.7%;T细胞纯度达到93.6%,NSC及星形胶质细胞培养及鉴定显示活力良好;T细胞杀伤实验显示:DC疫苗未引起明显NSC、星形胶质细胞损伤;(3)裸鼠成瘤实验:在接种细胞后第28天,GSC-DC疫苗组无裸鼠成瘤,阳性对照组有4只裸鼠成瘤(4/6);C57BL/6小鼠尾静脉注射疫苗实验:小鼠脑组织未见异常免疫炎症细胞浸润;血常规未见白细胞、淋巴细胞异常;肝肾功能未见异常。结论(1)经过规范制备的GSC-DC疫苗未见明显成瘤性;(2)GSC-DC疫苗未引起明显的免疫异常及不良反应。