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牛副流感病毒3型(BPIV3)为副黏病毒科呼吸道病毒属,不分节段的单股负链RNA囊膜病毒。有报道显示,BPIV3的感染不仅需要招募宿主细胞蛋白参与自身复制,而且需要激活宿主相关信号分子来帮助其完成生命周期。因此,系统而全面地获得BPIV3感染后与其互作的宿主细胞蛋白,并解析其介导的信号通路,具有重要的科学意义。本研究采用i TRAQ蛋白质组学技术分析了BPIV3与宿主细胞蛋白之间的互作,获得了BPIV3感染宿主细胞差异蛋白表达谱。在蛋白质组学结果分析的基础上,探究了p38MAPK信号通路和胆固醇分子在BPIV3复制过程中的作用,为揭示BPIV3致病机制奠定基础。具体研究内容如下:1.BPIV3单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA(DAS-ELISA)方法的建立利用纯化的BPIV3病毒,制备了3株抗BPIV3的单克隆抗体。3株单抗可以与BPIV3感染的细胞发生特异性反应,能够特异性识别BPIV3病毒粒子,为后续的实验检测提供了基础。在获得单克隆抗体的基础上,建立了BPIV3 DAS-ELISA检测方法。所建方法特异性、灵敏性和重复性良好,适用于兽医基层临床样品的大规模检测。2.BPIV3感染MDBK细胞的蛋白质组学研究采用i TRAQ结合2D LC-MS/MS高通量蛋白质组学技术,对BPIV3感染MDBK细胞的蛋白表达情况进行检测和分析。共鉴定出116个差异表达蛋白,74个蛋白表达上调,42个蛋白表达下调。生物信息学分析表明,差异蛋白主要富集在信号转导、脂质代谢、感染性疾病、免疫调控和炎症反应等过程中。为了进一步验证蛋白质组学结果的可靠性,采用实时荧光定量PCR方法对8个差异表达蛋白的m RNA进行了检测,结果与蛋白质组学结果一致。3.BPIV3感染激活p38 MAPK信号通路前期蛋白质组学分析结果发现,MAPK信号通路中多个蛋白在BPIV3感染过程中显著上调,其中MKK3是p38 MAPK通路中的关键激酶,这提示p38 MAPK可能与BPIV3的增殖相关。结果显示,BPIV3在感染后能够诱导MKK3的激活以及p38的磷酸化,激活了p38 MAPK信号通路。而且p38 MAPK信号通路参与了BPIV3的复制过程。ELISA检测BPIV3感染后以及使用抑制剂SB202190处理后的细胞上清中IL-6、IL-8、IL-13和TNF-α的水平发现,p38 MAPK信号通路参与了BPIV3诱导的炎症反应。4.胆固醇分子在BPIV3感染MDBK细胞中的作用此外,蛋白质组学分析结果显示,多个差异表达蛋白参与了脂代谢过程,其中LDLr和SAR1A是调节胆固醇内吞与外排的关键蛋白。为了研究胆固醇分子在BPIV3感染MDBK细胞中的作用,通过去胆固醇药物MβCD去除细胞膜胆固醇及病毒囊膜胆固醇。结果表明去除细胞膜胆固醇能够抑制BPIV3进入细胞及其复制,去除病毒囊膜胆固醇能够显著降低BPIV3的感染性。上述结果表明,本研究获得了系统而全面的BPIV3感染MDBK细胞的差异蛋白表达谱。对差异蛋白的进一步研究发现,p38 MAPK信号通路及胆固醇分子参与了BPIV3的复制过程,为阐明BPIV3致病机理及抗病毒策略的制定提供一定的理论基础。