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目的： 结直肠癌是人类常见的消化系统癌症之一。特别是近几年，结直肠癌的发病率不断上升。结直肠癌的发生发展是一个多因素作用且过程复杂的病理过程。人口的老龄化，遗传因素、危险因素的增加（如肥胖、吸烟、饮酒）以及不利的现代饮食习惯与结直肠癌的发生和发展密切相关。而脂肪酸代谢作为人体内重要的代谢途径，它与肿瘤的关系一直是研究的热点。多不饱和脂肪酸作为脂肪酸代谢重要的组成部分，它的改变必将会对肿瘤的发生和发展产生重大影响。本课题组长期致力于脂肪酸代谢与结直肠癌关系的研究。课题组前期通过对结直肠癌病人血清样本的代谢谱分析，发现与多不饱和脂肪酸代谢相关的通路出现异常。同时发现多不饱和脂肪酸对结直肠癌细胞的生长、迁移、侵袭等多方面有影响。本实验课题为了探究脂肪酸代谢的变化对结直肠癌的影响，从脂肪酸的重要组成部分--多不饱和脂肪酸入手，以多不饱和脂肪酸代谢通路关键酶FADS1基因为切入点，设计实验使FADS1蛋白的表达下降从而抑制多不饱和脂肪酸的合成，其目的在于观察FADS1蛋白表达量的降低对结直肠癌细胞的影响，以便探寻FADS1基因以及多不饱和脂肪酸在结直肠癌中的作用，为结直肠癌的临床治疗提供新思路。 方法： 1、使用 life technology公司提供的RNAi功能模块设计两条 shRNA，进行质粒重组后，利用含有FADS1shRNA的重组质粒对结直肠癌细胞DLD-1进行转染，并通过G418的筛选得到FADS1稳定敲低的细胞株。 2、将FADS1KD细胞株进行细胞功能实验，分析FADS1KD细胞株与对照细胞株细胞功能的差异。 （1）利用CCK-8试剂盒测定FADS1KD细胞株和对照细胞株的增殖速度，绘制增殖曲线； （2）在六孔板内接种少量细胞，长时间培养后，检测FADS1KD细胞株和对照细胞株单个细胞形成细胞克隆的能力； （3）同等条件下观察FADS1KD细胞株和对照细胞株对划痕的修复能力； （4）利用Transwell小室测定FADS1KD细胞株和对照细胞株的迁移能力； （5）利用基质胶模仿细胞外基质，在Transwell小室中测定FADS1KD细胞株和对照细胞株的侵袭能力。 3、大量培养结直肠癌细胞，进行线粒体提取，再利用超高速离心分离线粒体膜和基质，最后利用Glycine-SDS-PAGE电泳技术来确定FADS1蛋白在细胞和线粒体内的定位情况。 4、在FADS1KD细胞株密度达到50-60％时，进行线粒体功能实验，分析FADS1KD细胞株和对照细胞株线粒体功能的差异。 （1）利用多功能酶标仪和ROS检测试剂盒检测FADS1KD细胞株和对照细胞株线粒体ROS生成量； （2）利用多功能酶标仪和TMRM荧光染料检测FADS1KD细胞株和对照细胞株线粒体膜电位水平； （3）利用多功能酶标仪和ATP检测试剂盒检测FADS1KD细胞株和对照细胞株ATP生成量。 5、利用Glycine-SDS-PAGE电泳技术对FADS1KD细胞株和对照细胞株内与线粒体凋亡相关的蛋白进行表达量的分析，主要检测BAX/BCL-XL的变化。 6、通过对所收集的临床组织的石蜡切片进行免疫染色，根据染色的深浅来反应FADS1基因在组织中的表达强度，对细胞实验的结果进行验证。 结果： 1、通过RNA干扰，两条shRNA都可以使FADS1KD细胞株中FADS1的表达量明显下降。 2、FADS1KD细胞株中，KD-2增殖速度明显增加，而KD-1增殖速度无显著性差异。3、FADS1KD细胞株与正常对照相比，单个细胞形成克隆的能力增加，FADS1KD细胞株形成的细胞克隆数量更多，体积更大。 4、FADS1KD细胞株与正常对照相比，对划痕的修复能力更强。 5、FADS1KD细胞株无论是在迁移还是侵袭实验中，穿过小室的细胞数都明显多于正常对照组。 6、提取线粒体后，以正常完整结直肠癌细胞为对照，证明FADS1蛋白在细胞内定位于线粒体。将单独线粒体裂解后，通过高速离心分离膜和基质，发现FADS1在线粒体的膜和基质中同时存在。 7、FADS1KD细胞株与正常对照相比，线粒体内的ROS呈显著性降低。 8、FADS1KD细胞株与正常对照相比，线粒体膜电位水平、ATP生成量均有所上升。 9、在FADS1KD细胞株中，线粒体凋亡相关蛋白BAX的表达量下降而BCL-XL的表达量上升。 10、在结直肠癌组织石蜡切片中，原发癌与癌旁正常组织相比，FADS1的表达量下降，而转移癌与原发癌相比，FADS1表达量进一步下降。 结论： 通过对结直肠癌细胞DLD-1中多不饱和脂肪酸代谢关键酶FADS1基因的敲低，我们发现，敲低细胞株的增殖速度加快，克隆形成能力和迁移侵袭能力均增强。在证明了FADS1定位于线粒体的膜和基质上后，我们又对FADS1KD细胞株线粒体功能进行探究，发现敲低细胞株线粒体内ROS产生减少而膜电位水平和ATP生成量均有所增加。