银杏(Ginkgo biloba L.)是一种植物药,数世纪以来,因其药用特性在国际上备受关注,银杏叶制剂已被证明可用于临床治疗。因此,在过去几年中,银杏及其它植物药作为膳食补充剂的使用量急剧增加,银杏叶的市场规模逐年增长,这使得银杏叶成为美国和欧洲最畅销的膳食补充剂之一。同时,植物药使用量的激增,也引起了人们对此类制剂的质量、安全性和有效性的关注。据报道,银杏叶提取物中含有60多种具有生物活性的物质。作为主要活性成分的萜烯内酯占总生物活性成分的5～7%,可用于临床治疗,并且其药理活性与黄烷醇苷的协同作用有关,黄烷醇苷占总银杏叶提取物中生物活性成分的22～27%。银杏叶提取物(Ginkgo biloba Extract,GBE)的药理活性成分包括银杏内酯A、B、C和银杏内酯。萜烯内酯已被用于保护心脑血管和神经退行性疾病,如老年痴呆症和阿尔茨海默病。它是一种强效的抗氧化剂,能拮抗血小板活化因子(PAF)。据报道,银杏内酯对其他病症也有治疗效果,包括缺血性脑损伤,缺血后神经元损伤和炎症。近年来,在不同的细胞和动物模型中发现银杏叶提取物的抗癌作用与其抗氧化、抗血管生成和基因调控活性有关。然而,直到最近才有关于这些天然产物及其口服后代谢物的吸收、代谢、生物利用度和生物活性的研究。为了更合理的使用植物药,了解其在生物体中的过程是十分必要的,包括体内的代谢途径和动力学,这些通常是由药物代谢酶或药物转运蛋白介导的。人体禁食状态下银杏内酷的生物利用度很高,Fourtillan等人报道了 口服给药后银杏内酯A、银杏内酯B和白果内酯的绝对生物利用度分别为80%、88%和79%,它们广泛分布于人体不同的组织中,当大剂量给与上述化合物后,经尿液排泄的量基本不变,银杏内酯A为72.3%、银杏内酯B为41.4%和白果内酯为31.2%。给药后6小时内,组织浓度下降较快,银杏内酯A、银杏内酯B和白果内酯代谢物主要通过尿液、粪便和胆汁排出。这些生物学过程表明,药物代谢酶和药物转运蛋白参与这些化合物的处置过程。银杏内酯为亲脂性化合物,内酯环的存在使其在人体生理pH下易于电离,这预示银杏内酯可通过被动扩散作用摄取或外排。药物转运蛋白与药物的吸收、分布、消除有关,并影响药物的治疗效果和不良反应。膜转运蛋白能显著影响药物的药代动力学、安全性和功效,近年以来,有许多相关研究报道了基于转运蛋白的药物-药物相互作用。因此,研究银杏内酯和白果内酯与药物转运蛋白的相互作用,了解药物转运蛋白在这些化合物的药代动力学中的作用,对避免潜在的药物-药物相互作用具有重要的意义。然而,目前关于银杏内酯和白果内酯的药代动力学与转运蛋白关系的相关信息较少。本研究采用体外和体内模型,评价银杏内酯和白果内酯与不同组织(尤其是肾脏和大脑)上表达的药物摄取和外排转运蛋白之间的相互作用,阐明这些转运蛋白在银杏内酯的组织分布和排泄中的作用,并对转运机制进行研究。一、测定生物样品中银杏内酯和白果内酯的UPLC/MS-MS分析方法的建立无论是在体外还是在体内研究植物药与药物转运体之间的相互作用,都需要准确地测定生物基质中化合物的浓度。质谱是测定生物样品中药物含量的一种灵敏、特异的方法。因此,我们建立并验证了一种超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)方法,用于同时定量细胞裂解液、大鼠血浆、组织和尿液中银杏内酯A、B、C和白果内酯的含量。我们优化了样品前处理方法,可去除空白基质中的干扰物,使用50 μM抗坏血酸预处理样品并在复溶溶剂中加入抗坏血酸和甲酸显著降低了基质效应,并增加了样品稳定性,采用甲基叔丁基醚进行液-液萃取。银杏内酯及白果内酯分析,使用Zobrax RRHD柱(extend-C18 1.8μm,3.0 x 100mm),以乙腈:水(含1%甲酸)作为流动相进行梯度洗脱,采用多反应监测在负离子扫描模式下进行分析。为进行体内银杏内酯A,B,C和白果内酯与转运蛋白的相互作用和药代动力学研究,建立了大鼠血浆、肾、肝、心、肺、脑和尿液中银杏内酯和白果内酯含量测定的UPLC/MS-MS方法。大鼠血浆及组织匀浆液的色谱图中不含干扰峰,方法的线性范围为4～1000 ng/mL,银杏内酯A、B、C和白果内酯的定量下限(LLOQ)均为4 ng/mL;在3种QC浓度下准确度为85.0%～1 14.9%,精密度RSD<7.32%;回收率(除银杏内酯C)在77.3 8%～107.4%之间;基质效应在92.1%～116.0%之间。以血浆、肾脏和脑为基质代表,进行了短期室温、长期低温贮存、自动扩增条件和冻融循环稳定性试验。结果表明,除在短期室温贮存条件下血浆中的银杏内酯和白果内酯稳定较差外,其他条件下,化合物稳定性良好;因此,样品制备后,立即测定。该方法测定细胞裂解液中的化合物时,空白细胞裂解液没有干扰,在质量浓度20～5000 nM范围内线性关系良好,校准曲线上对照品的最低浓度20 nM为检测方法的定量下限LLOQ,三种QC浓度下该方法的准确度为88.3～126.6%、精密度RSD<11.0%、回收率为94.3%～105.9%、基质效应为93.8%～111.0%。样品稳定性试验表明,上述化合物的短期室温、自动进样器、反复冻融、-20℃长期贮存及储备液中稳定性良好。二、大鼠体内银杏内酯和白果内酯药代动力学和组织分布应用建立的UPLC/MS-MS方法测定了大鼠体内银杏内酯和白果内酯的浓度,并对其进行了药代动力学和组织分布研究。药代动力学研究结果表明,银杏内酯和白果内酯可迅速进入体内循环系统(口服给药后5min即可在血液中检测到),银杏内酯A、B、白果内酯的血药浓度在1.5 h达到峰值。上述化合物迅速吸后在大鼠血浆中消除较为缓慢。银杏叶提取物(GBE)按照60mg/kg的剂量经口给药后,我们发现银杏内酯C在大鼠血浆中的浓度较低,仅在前几个采样时间点可检测到。银杏内酯A、B和白果内酯的口服生物利用度较好,分布广泛,在肝脏和肾脏组织中浓度较高,而在脑中分布量较低。对白果内酯和含白果内酯提取物的比较研究表明,提取物中的白果内酯在大鼠血液中的含量较高,其Cmax、AUC和生物利用度均显著高于单用白果内酯。三、OAT1/3对银杏内酯和白果内酯药代动力学及处置的影响OATs在肾脏的分泌中起着至关重要的作用,此类转运体的活性变化可引起许多药物的清除及其功能改变,进而导致药代动力学的变化。萜烯内酯类化合物主要通过肾脏途径消除,银杏内酯和白果内酯在生理pH条件下易于电离,因此我们推测,肾脏有机阴离子转运蛋白1(OAT1)和有机阴离子转运蛋白3(OAT3)可能参与它们的肾脏消除过程。本文应用过表达OAT1或OAT3的MDCK及人胚肾293(HEK293)细胞系考察了这两种转运体对这些化合物的摄取情况,揭示OAT1/3在转运银杏内酯A、B、C和白果内酯中的作用,以及OAT1/3抑制剂对这些化合物的药代动力学、尿排泄和生物利用度的影响。为明确转运蛋白的作用,我们研究了银杏内酯或白果内酯与OAT1/3之间的体外相互作用,以确定银杏内酯或白果内酯是否是这些转运蛋白的底物。即确定银杏内酯A、B、C和白果内酯是否为转运蛋白为底物,何种化合物不能通过OAT1/3转运。MDCK-OAT1细胞对银杏内酯A、B和白果内酯的摄取与MDCK-mock细胞的摄取有显着性差异,这表明OAT1参与了银杏内酯A、B和白果内酯的转运。MDCK-OAT1细胞对银杏内酯A,B和白果内酯的摄取量分别比MDCK-mock高3倍、4倍和3倍。该结果说明银杏内酯A,B和白果内酯可能是OAT1的底物。当MDCK-OAT1细胞预先与OAT抑制剂1mM丙磺舒孵育时,可显著降低或抑制银杏内酯和白果内酯的摄取。这进一步表明银杏内酯A、B和白果内酯是OAT1的底物。同样地,银杏内酯A,B和白果内酯在HEK293-OAT3细胞的摄取量比HEK293-mock细胞高5～7倍,这也表明OAT3能够摄取这些化合物。并且,在丙磺舒存在的情况下,OAT3介导的银杏内酯A,B和白果内酯的细胞摄取量显著降低。同时,通过浓度依赖性转运实验进一步证明了 OAT1和OAT3介导了银杏内酯A,B和白果内酯转运。通过浓度依赖性转运实验进一步表明OAT1和OAT3介导了银杏内酯A、B和白果内酯的转运。OAT3转运银杏内酯A、B和白果内酯的速度是OAT1的2倍左右。此外,OAT1/3转运银杏内酯A和B的速度是白果内酯的3倍左右。总体而言,OAT1/3优先转运银杏内酯A和B。上述研究结果表明,银杏内酯A、B和白果内酯可通过OAT1/3转运排出肾脏,预测这些转运蛋白在上述化合物的PK过程中发挥作用。上述体外实验数据表明,相较于白果内酯,OAT1/3更易于转运银杏内酯A和B,推测OAT1在银杏内酯的肾排泄中较OAT3发挥更大作用。在体外试验基础上,我们进行了大鼠模型的验证实验。以100 mg/kg给与大鼠银杏叶提取物,提前15 min给予大鼠OAT1/3抑制剂丙磺舒(50mg/kg)后,银杏内酯A、B、C和白果内酯的血浆浓度显著升高。丙磺舒可使其在大鼠中银杏内酯 A、B 和白果内酯的 AUC 显著增加(893.48 1123.85、314.91 505.74 和2724.97 3096.40 μg/L*h)。预先给与丙磺舒后银杏内酯A、B和白果内酯的大鼠的肾清除率明显降低。银杏内酯A、B、C和白果内酯的PK参数AUC、Cmax和t1/2有显着性差异。当给与大鼠丙磺舒后,银杏内酯A、B和白果内酯的AUC0-T分别下降了 1.4、3.1和1.2倍。未给予丙磺舒组的大鼠肾脏中银杏内酯和白果内酯的量高于给与丙磺舒组,这是由于上述化合物从血液摄取至肾细胞时转运体未受到抑制。与给与丙磺舒组大鼠相比,未给与组大鼠体内银杏内酯的Cmax分别为A,B和白果内酯增加1.8倍,2.4倍和1.5倍。为了进一步探究银杏内酯A、B、C或白果内酯与丙磺舒之间的药物-药物相互作用,我们还对口服联合用药后的银杏内酯A、B、C或白果内酯的肾排泄情况进行了评估。当单独给药时,银杏内酯A、B、C和白果内酯在36h内的累积尿液排泄量分别为22.0%、79.0%、5.0%和55.0%。当共同给予银杏叶提取物(GBE)和丙磺舒时,银杏内酯A、B、C和白果内酯的累积尿排泄分别降至13.0、59.0、7.0和 32.0%。四、OCT2、MATE1和MATE2-K与银杏内酯及白果内酯转运的关系肾脏中还表达其它转运蛋白,它们也可能涉及银杏内酯和白果内酯的排泄和转运,可能与OAT1/3一起发挥作用,从而进一步影响银杏内酯和白果内酯的药物代谢动力学。鉴于OAT1/3是肾近小管细胞基底外侧的摄取转运蛋白,我们推测,银杏内酯和白果内酯的肾小管转运可能涉及多个药物转运体。为此,我们应用过表达药物转运体的MDCK细胞,研究了银杏内酯和白果内酯与有机阳离子转运体(OCT2)、毒素外排转运蛋白1(MATE1)和2-K(MATE2-K)的作用。将上述细胞接种于24孔细胞培养板上,待细胞生长至紧密的单层,验证细胞功能。然后考察银杏内酯及白果内酯是否为药物转运体的抑制剂,并以此作为筛选底物的基础,并考察了 OCT2、MATE1和MATE2-K对银杏内酯和白果内酯的转运特征。MATE1和MATE2-K对银杏内酯和白果内酯转运作用十分明显。实验结果表明银杏内酯和白果内酯均为MATE1/MATE2-K的低亲和力底物,Km值为511～2229μM。银杏内酯A和B与MATE1相互作用时,其清除率(CL)值分别为1.29μL/mg蛋白/min和1.20 μL/mg蛋白/min,银杏内酯A的清除率(0.8 μL/mg蛋白/min)高于MATE2-K,表明MATE1在银杏内酯A和B的转运中起到了更大作用。然而,对于白果内酯,MATE1和MATE2-K的Km分别为1476 μM和1375 μM,这表明白果内酯与上述转运体的亲和力相似。此外,它们的转运效率基本相同(0.3 μμL/mg蛋白/min),这表明两种转运蛋白作为其底物在摄取白果内酯方面具有相似性。综上所述,研究结果表明MATE1/2-K参与了银杏内酯A、B和白果内酯的转运及肾消除过程。当银杏内酯及白果内酯的浓度为100μM时,可以抑制MATE1及MATE2-K介导其经典底物1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)转运。而临床数据表明,银杏内酯A、B和白果内酯的平均血浆浓度分别在42～105 nM、22～43 nM和58～180 nM之间。因此,银杏内酯和白果内酯能对MATE1及MATE2-K的抑制作用可能没有临床意义。五、银杏内酯和白果内酯在HBMEC和MDR1 BCRP-,MRP2-过表达细胞的透过性我们应用HBMEC模拟BBB模型,并用于评估了银杏内酯和白果内酯的细胞透过性。本研究还考察了银杏内酯和白果内酯与在脑中高表达的外排转运蛋白的相互作用。在HBMEC单层的双向转运实验中,银杏叶提取物(GBE)的给药浓度为100μg/mL,并检测了给与0.1 mM维拉帕米后,银杏内酯和白果内酯在HBMEC细胞中的转运是否受到影响。此外,我们测定了过表达MDR1、BCRP和MRP2的MDCK细胞中的银杏内酯A、B、C和白果内酯的浓度。同时也考察了大鼠按照100 mg/kg单次灌胃给与银杏叶提取物(GBE)后,其脑组织中银杏内酯A、B、C和白果内酯的浓度。实验结果显示,银杏内酯A、B、C和白果内酯的外排率在1.67～2.37之间,表明HBMEC细胞中存在的药物转运体介导了上述化合物的外排。在HBMEC细胞模型BL-AP转运银杏内酯和白果内酯的实验中,当与维拉帕米(MDR1的经典抑制剂)一起孵育时,银杏内酯和白果内酯的外排量被显著抑制。积聚实验中,银杏内酯和白果内酯与MDR1、BCRP和MRP2细胞的相互作用实验表明,MDR1可介导银杏内酯A、B、C和白果内酯外排,并且这种现象可被维拉帕米抑制,该结果进一步证实了 MDR1参与其转运。而在LLCPK1-BCRP和MDCK-MRP2及其相对应的LLCPK1-mock和MDCK-mock细胞之间,银杏内酯A、B、C和白果内酯的积聚量没有差异。在大鼠灌胃给药后5min,银杏内酯A、B和白果内酯的脑-血浆比分别为1.02、4.01和1.28,在1 h后脑-血浆比急剧下降至0.06、0.11和0.08。综上所述,银杏内酯A、B、C和白果内酯在脑内生物活性低可能是由于MDR1介导其外排引起的。六、总结综上所述,本研究建立并验证了银杏内酯A、B和白果内酯超高效液相色谱-质谱检测分析方法,可用于评估药物转运蛋白在银杏内酯和白果内酯的药代动力学、分布和肾排泄作用。结果表明,银杏内酯和白果内酯的肾脏消除有转运体参与,摄取和外排转运蛋白均发挥了作用。位于肾小管细胞的基底外侧膜的OCT2,OAT1和OAT3介导了银杏内酯和白果内酯从血液至近端肾小管细胞中的摄取,外排转运蛋白MATE1和MATE2-K以及MDR1介导了上述化合物从近端肾小管细胞至尿液的转运。药代动力学实验结果表明,OAT1/3的活性可影响大鼠中银杏内酯A、B、C和白果内酯的药代动力学。另一方面,我们的研究结果还表明,银杏内酯和白果内酯在大鼠脑中的分布较少,MDR1的外排作用可能是其在大鼠脑中分布量低的原因。