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猪传染性胸膜肺炎(Porcine Contagious Pleuropneumonia,PCP)是由猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的主要以胸膜肺炎和出血性坏死性肺炎为特征的一种高度接触传染性呼吸道疾病。胸膜肺炎放线杆菌血清型、毒力因子、基因组结构及其基因表达调控错综复杂。目前,对APP分子致病机理不清楚。双组份调控系统(two-tomponent regulatory system,TCS)广泛存在于革兰氏阳性和阴性细菌中,大量研究表明,作为一种信号传递工具,可参与调控细菌致病性、生长代谢、耐药性、毒力因子表达和致病等多种重要生物学功能,尤其在致病性方面,正逐渐成为研究的热点。
鉴于以上背景,本研究在已有的APP JL03,L20(5b),AP76,菌株全基因组序列的基础上,以国内流行的强毒株APP血清1型SLW01菌株为亲本,开展了QseB/QseC双组分调控系统功能及可能的调控机制研究。主要研究内容包括:
1.双基因缺失突变株(△QseBC)的构建与鉴定
以SLW01基因组DNA为模板,参照Genbank中QseB、QseC基因的序列,从SLW01菌株中扩增了QseB/QseC基因的上下游片段。通过T/A克隆将得到的上下游片段,连接到pEASY-T1上,酶切后,连接到自杀性质粒pEMOC2上,构建缺失了2092bp大小的双基因重组自杀性质粒pEM△QseBC。质粒测序鉴定,与Genbank中血清1型APP的qseB、qseC上下游序列同源性均为100％。
将重组自杀性质粒转入大肠杆菌供体菌β2155,以菌株SLW01为受体菌进行接合转移,采用基于氯霉素(Cm)正向筛选标记与蔗糖(SacB)负向选择标记通过两步同源重组的方法筛选出Cm敏感蔗糖抗性的克隆,进行PCR鉴定,确定发生了第二次单交换,自杀性质粒已丢失。并进一步通过反转录PCR和测序证实,确认双基因缺失突变株△QseBC构建成功。
2.基因缺失突变株(△QseBC)生物学特性及小鼠致病性的研究
双基因缺失突变株在体外能够稳定的遗传。突变株和亲本株的生长速率及溶血活性均无显著差异。负染电镜结果表明,亲本菌可以表达完整菌毛,而突变株菌毛没有表达。但测定基因缺失突变株与亲本菌的Balb/C小鼠的LD50,结果显示,与亲本菌SLW01比较,△QseBC的毒力有所下降。比较基因缺失突变株与亲本菌株的组织带菌量,结果表明,△QseBC在感染初期,组织(肺脏、血液)带菌量明显低于亲本菌。
3.基因缺失突变株与野毒株基因表达谱分析及差异基因的筛选
利用APP基因表达谱芯片分析亲本菌和基因缺失突变株对数期的转录谱,对芯片杂交的原始数据统计分析,找出了基因缺失突变株与亲本菌株的一些差异表达基因(±1.5倍为阈值),结果表明:上调表达基因25个,下调表达基因27个,并通过qRT-PCR验证9个差异表达基因,上调和下调基因与芯片是一致的,表明芯片结果的可靠性。对差异表达基因做生物信息学分析,找出了三个可能调控的操纵子:APJL_0393(glycerol kinase),pilM(Tfp pilus assembly protein),APJL_1066(Putativeheme iron utilization protein)。推测pilM为QseB可能调控基因。
4.EMSA验证调控蛋白QseB与差异表达基因的相互作用
利用生物信息学方法预测三个可能调控的操纵子的启动子。凝胶阻滞实验(EMSA)结果表明:未经磷酸化处理的调控蛋白QseB均不与三个基因簇的启动子结合。磷酸化处理的QseB不能与APJL_0393,APJL_1066的启动子结合。但QseB可以与pilM的启动子结合,且比较稳定。结果表明,pilM基因受QseB蛋白调控。
5.基因缺失突变株△pilM的构建及生物学特性的研究
为了解释突变株△QseBC感染初期组织带菌量的明显降低、菌毛表达减少等表型的变化是否是由于pilM表达下调引起,进一步通过重叠延伸技术(SOE-PCR)构建pilM缺失突变株(△pilM)。从SLW01的基因组中扩增pilM基因的上下游同源臂,混合上下游的DNA片段,由于有重叠区,重叠片段之间退火,延伸成异源双链,加入外侧引物进行第三次PCR,得到由上下游同源臂构成的融合基因。快速连接到pEASY-T3,酶切后连接到重组自杀性质粒得pEM△pilM。质粒测序鉴定,与Genbank中血清1型APP的qseB、qseC上下游序列100％同源。重组自杀性质粒经过接合转移,两次同源重组,构建了基因缺失突变株△pilM。RT-PCR在RNA水平上进一步验证突变株构建成功。
基因缺失突变株在体外可以稳定遗传,与亲本菌株相比,生长、溶血活性没有显著差别。电镜负染(TEM)结果,亲本菌株可以表达完整的菌毛,突变株△pilM菌毛缺失。基因缺失突变株与亲本菌株进行粘附能力比较实验,结果表明,突变株的黏附能力下降了50％。测定基因缺失突变株较亲本菌株对小鼠致病力(LD50),突变株的毒力下降(2.36倍)。
通过以上实验结果表明,双组份调控系统△QseBC可能通过调控pilM基因的表达来影响APP黏附、菌毛表达,致病性。