论文部分内容阅读
研究背景糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是严重威胁人类健康和生命的重大疾病,发病率和病死率逐年攀升,并呈年轻化趋势。患者中约95%为2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM),病情控制现状令人堪忧。目前治疗T2DM的药物仍以磺酰脲类、双胍类等口服降糖药为主,但该类药物最常见最危险的不良反应是引起持久性的低血糖,长期使用会因胰岛素过度分泌而导致胰岛β细胞功能衰竭。此外,由于T2DM的传统治疗侧重于缓解高血糖症状,而不是针对其真正发病原因,致使多数患者都无法逆转血糖控制能力的持续下降、β细胞数量的减少和功能的降低,因此研发疗效更好、使用安全,能够有效控制糖尿病多种症状及并发症的新型治疗药物,是当今新药研发领域的热点和重点。研究目的胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1, GLP-1)是一种重要的肠道内分泌激素,具有降低过高血糖、促进胰岛素分泌、刺激胰岛β细胞增殖、抑制胰高血糖素分泌、降低胰岛素抵抗、延缓胃排空、抑制食欲、保护心血管和神经系统等作用,具备理想降糖药的多种特征,目前已成为糖尿病治疗药物研究领域倍受瞩目的研发热点。但由于天然的GLP-1在体内极易被DPP IV降解失活,限制了其临床应用,因此设法延长其作用时间是目前的攻关重点。本课题是在此基础上,采用前药设计思路,应用DNA重组技术将多个GLP-1活性分子通过连接肽融和,构建重组人胰高血糖素样肽-1前药(Prodrug of recombinant human GLP-1, Pro-rhGLP-1),并建立Pro-rhGLP-1的高效表达、纯化方法,观察Pro-rhGLP-1的体内外释药性能,并对其进行系统的药效学研究。研究方法1. Pro-rhGLP-1标签融合蛋白的表达、纯化和活性分析:采用融合标签技术,将合成的Pro-rhGLP-1基因克隆至大肠杆菌质粒载体pET32a(+)中,构建Trx·Tag和His·Tag与Pro-rhGLP-1的融合表达载体pET32a(+)- Pro-rhGLP-1;转化大肠杆菌BL21(DE3),构建表达菌株E. coli BL21(DE3)/ pET32a(+)-Pro-rhGLP-1;IPTG诱导表达,12%SDS-PAGE检测蛋白表达量并进行可溶性分析;包涵体蛋白经洗涤溶解后透析复性;复性成功后采用Ni-NTA亲和层析纯化Pro-rhGLP-1标签融合蛋白;纯化后经肠激酶酶切去除融合标签;SDS-PAGE和HPLC分析蛋白纯度;Western blot鉴定蛋白的特异性;OGTT检测Pro-rhGLP-1的体内生物学活性。2. Pro-rhGLP-1无标签重组蛋白的表达、纯化和活性分析:采用PCR方法扩增Pro-rhGLP-1基因序列,克隆入去除标签的大肠杆菌质粒载体pET41a(+)中,同时采用Klenow片段补平酶切后5’末端的方法进行目的基因序列和pET41a(+)的平端连接,构建无标签表达载体pET41a(+)- Pro-rhGLP-1(Tag-free);转化大肠杆菌BL21(DE3),0.01 mM IPTG诱导目的蛋白表达;包涵体经梯度浓度尿素洗涤后溶解在8 M尿素中,采用Q-Sepharose FF阴离子交换柱和Superdex 75凝胶过滤柱对目的蛋白进行分离纯化;蛋白透析复性后去除内毒素并冷冻干燥;HPLC分析蛋白纯度;Western blot鉴定蛋白特异性;OGTT检测目的蛋白的体内生物学活性;对冻干后的活性蛋白进行氨基酸组成分析、N末端氨基酸序列测定、C末端氨基酸序列测定、肽图分析、MALDI-TOF-MS分析等完成结构确证;完成目的蛋白的结构确证后,保留工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET41a(+)-Pro-rhGLP-1(Tag-free),并进行传代稳定性研究。3. Pro-rhGLP-1的释药性能及药效学研究:建立Pro-rhGLP-1与人血浆的共孵育体系,在不同时间点取样,通过Western blot对Pro-rhGLP-1的降解过程进行特异性分析,再通过ELISA,检测小鼠皮下注射Pro-rhGLP-1后的不同时间点血浆GLP-1水平,初步评价Pro-rhGLP-1的体内外释药过程;在离体分离的胰岛上观察Pro-rhGLP-1的体外促胰岛素分泌活性;在C57BL/6J和糖尿病db/db小鼠上观察单次和持续6周给药过程中,Pro-rhGLP-1对血糖水平、胰岛素分泌量、葡萄糖耐受性、胰岛素敏感性、摄食、体重、脂质含量及胰岛形态和功能的影响,对Pro-rhGLP-1进行系统的药效学评价。实验结果1.Pro-rhGLP-1标签融合蛋白的表达、纯化和活性分析:成功构建带有融合标签Trx·Tag和His·Tag的大肠杆菌表达载体pET32a(+)-Pro-rhGLP-1。0.01、0.1和1.0 mM IPTG均能诱导Pro-rhGLP-1标签融合蛋白的表达,融合蛋白分子量约35KD。融合表达产物主要以包涵体形式存在,表达量约为细菌总蛋白的50%。用不含尿素的0.02 M PBS洗涤后,少量包涵体可以溶解,含8 M尿素的PBS能够溶解约80%的包涵体蛋白。经Ni-NTA亲和层析分离纯化后,可得到纯度为95.43%的目的蛋白。C57BL/6J小鼠的OGTT结果表明,纯化后的Pro-rhGLP-1呈剂量依赖性降低血糖浓度,同时升高血浆胰岛素水平,等剂量Pro-rhGLP-1的降糖作用较GLP-1作用更强。2.Pro-rhGLP-1无标签重组蛋白的表达、纯化和活性分析:成功构建大肠杆菌表达载体pET41a(+)-Pro-rhGLP-1 (Tag-free)。0.01、0.1和1.0 mM IPTG均能诱导Pro-rhGLP-1的表达,分子量约19KD。表达产物主要以包涵体形式存在,表达量约占细菌总蛋白60%以上,降低诱导温度和降低IPTG浓度均未能实现目的蛋白的可溶性表达。用多种不含尿素的缓冲液在不同pH值时洗涤包涵体,效果均不佳,换用梯度浓度尿素对包涵体进行洗涤,8 M尿素可以溶解90%以上的包涵体。溶解后的包涵体经离子交换和凝胶过滤层析分离纯化后,纯度达97.55%。透析复性后测定生物学活性,结果表明,Pro-rhGLP-1在体内具有生物学活性,可以降低血糖,升高血清胰岛素水平,且降糖作用较GLP-1更强。结构确证结果与预期一致。工程菌E.coli BL21(DE3)/pET41a(+)-Pro-rhGLP-1(Tag-free)连续传至50代,质粒未丢失,表达量稳定,表达产物正确。3.Pro-rhGLP-1的释药性能及药效学研究:(1)与血浆共孵育15 min后,即可检测到来自Pro-rhGLP-1的GLP-1,GLP-1释放量随时间延长增加,孵育12 h后,约80%的产物为GLP-1;(2)C57BL/6J小鼠单次皮下注射Pro-rhGLP-1后12 h,血浆中仍可检测到高于基础水平的GLP-1;(3)在无血清培养的离体胰岛上,Pro-rhGLP-1不能促进葡萄糖依赖性的胰岛素分泌,而对照组GLP-1却可以显著刺激胰岛素分泌,并表现出良好的量效关系;(4)Pro-rhGLP-1(3 nmol/kg)降糖作用明显,糖尿病db/db小鼠单次皮下给药后的降糖作用可维持至少12 h。6周治疗过程中,db/db小鼠空腹血糖和HbA1c水平均显著降低,且在停药6周后仍维持在较低水平;(5)Pro-rhGLP-1(3 nmol/kg)可以显著促进胰岛素分泌,IGI较对照组增加8.2倍;(6)Pro-rhGLP-1可显著抑制摄食,中剂量(3 nmol/kg)给药后C57BL/6J小鼠的24 h摄食量减少了51±11%;给药6周期间,糖尿病db/db小鼠的摄食量较对照组减少了约32%;(7)Pro-rhGLP-1在有效减轻糖尿病小鼠体重的同时,也显著降低了体脂含量及血浆中的瘦素、甘油三酯和游离脂肪酸水平;(8)经Pro-rhGLP-1治疗6周后,db/db小鼠的HOMA-IR下降,QUICKI升高;(9)胰岛形态学分析结果表明,Pro-rhGLP-1治疗6周后,db/db小鼠胰岛面积增大,数量增多,还可刺激胰岛β细胞增殖。结论1.我们首次采用前药设计思路构建了GLP-1前体药物Pro-rhGLP-1,在大肠杆菌原核表达系统中,建立了Pro-rhGLP-1无标签重组蛋白的表达和纯化方法,获得了纯度大于95%的目标蛋白,为Pro-rhGLP-1作为药用蛋白的获得提供了简便易行的方法。2.体外无药理活性的Pro-rhGLP-1进入体内后可以缓慢降解,释放出多个GLP-1活性分子,释放时间长达12 h以上。3.在离体培养的胰岛上,Pro-rhGLP-1没有促胰岛素分泌效应。但在动物实验中,呈剂量依赖性的增加胰岛素分泌量并降低血糖,且不降低正常血糖;降糖作用较GLP-1强而持久,一次给药后可维持12 h以上;同时,Pro-rhGLP-1还能够提高葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性,促进胰岛β细胞增殖,降低体脂含量和甘油三酯水平,抑制摄食并减轻体重。4.Pro-rhGLP-1具有理想的降低血糖、保护胰岛功能、提高胰岛素敏感性及改善糖和脂质代谢障碍的作用,功效更全面,疗效强而持久,对2型糖尿病及相关肥胖具有显著治疗优势。