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糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病常见又严重的并发症之一,它是以肾小球系膜细胞增生,细胞外基质增多,肾小球基底膜增厚等病理生理改变及肾小球硬化为主要特征的病变。其发病机制复杂,与肾小球血流动力学改变、生化代谢紊乱,氧化应激,细胞因子、遗传易感性等多种因素有关。DN预后差,相比其它原因所致的肾脏疾病更难以治疗,其原因尚不清楚。研究表明,细胞因子分泌增多,细胞外基质(ECM)蛋白代谢异常在DN发病机制的各个环节起着重要作用,其中转化生长因子β1(TGF-β1)是一个重要的细胞因子,它的异常表达在ECM代谢过程中发挥重要的作用,可直接或间接促进ECM成分增加,是导致糖尿病患者肾脏纤维化的最后共同中介物质。此外,近来越来越多的证据表明,氧化应激(oxidative stress,OS)在糖尿病肾病发病中起重要作用;糖尿病状态下由于活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生增多和/或清除减少导致了氧化应激状态。ROS本身可攻击脂质、蛋白质和DNA,导致肾脏损害。脂联素(adiponectin,ADPN)是一种由白色脂肪组织分泌的蛋白产物,是脂肪组织在人血浆分泌最多的蛋白。脂联素又称30kD脂肪细胞补体相关蛋白(Acrp30)或28kD胶原结合蛋白(GBP28),人类脂联素基因由apM1 mRNA编码,位于染色体3q27上,全长16Kb,由3个外显子和2个内含子组成。自从1995年发现脂联素以来,多项研究已证实脂联素具有抗炎、改善胰岛素抵抗、抗动脉粥样硬化、降血糖、血脂等作用,最近研究发现脂联素还具有抗氧化作用。临床研究发现血浆ADPN浓度与糖尿病肾病关系密切。对早期糖尿病肾病的研究显示循环脂联素水平与尿蛋白呈负相关,说明早期糖尿病肾病内皮功能受损与低脂联素水平有关;进展期糖尿病肾病患者尿脂联素和血脂联素水平增加,认为其可能通过抗炎、抗动脉硬化等作用,减轻肾脏损害。然而脂联素对糖尿病肾病保护作用的机理研究甚少。因此我们在体外将脂联素作用于高糖诱导的人肾小球系膜细胞,观察其对细胞增殖、TGF-β1、活性氧簇(ROS)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)产生的影响,并对其相关信号通路进行探讨;同时构建表达ADPN的pIRES2-EGFP-gAd荧光质粒,将其转染糖尿病大鼠模型,探讨其对肾脏的保护作用与机理。本研究的目的、方法、结果、结论分三部分概述如下:第一章脂联素对系膜细胞氧化应激和TGFβ1的影响及细胞信号转导机制研究目的:观察脂联素对高糖诱导下肾小球系膜细胞ROS、eNOS以及TGF-β1产生的影响,并探讨腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路在这一过程中的作用。方法:体外培养人肾小球系膜细胞(HMCs),RT-PCR检测HMCs脂联素受体(adiponectin receptor,AdipoR)mRNA的表达。分别用高糖(30mM)和不同浓度(3-10ug/ml)重组人球形脂联素蛋白干预HMCs24、36小时, MTT试验观察细胞增殖情况。将细胞随机分为4组:对照组、高糖组(30 mM)、高糖+脂联素组和高糖+脂联素+AMPK抑制剂araA(adenine 9-β-D-arabinfuranoside)组,观察脂联素对高糖诱导的HMCs氧化应激和TGF-β1 mRNA和蛋白表达的影响。荧光探针检测ROS释放;RT-PCR检测eNOS和TGF-β1 mRNA表达,Western blot检测eNOS和TGF-β1蛋白水平。另外,为了进一步明确脂联素上述作用的细胞信号转导机制,用脂联素10ug/ml单独干预系膜细胞,分别于0、5、10、15、30min提取胞浆蛋白,Western blot检测磷酸化AMPK蛋白(p-AMPK)表达。结果:1)RT-PCR证实人肾小球系膜细胞上有AdipoR1和AdipoR2表达,半定量结果示AdipoR1明显占优势(AdipoR 1的表达强度是AdipoR 2的3.5倍);2)脂联素呈时间和剂量依赖性地抑制高糖刺激下的HMCs增殖;3)Western blot检测p-AMPK蛋白证实脂联素可以时间依赖的方式诱导系膜细胞AMPK磷酸化;4)高糖组HMCs的ROS释放量较对照组明显增加,eNOS产生减少,TGF-β1表达上调(p<0.05);脂联素处理后ROS产生量较高糖组明显减少,eNOS表达上调,TGF-β1产生减少(p<0.05);加入AMPK抑制剂araA后,可部分抑制脂联素的上述作用。结论:1、脂联素能够抑制高糖诱导的HMCs增生和活性氧产生,促进eNOS产生,下调TGF-β1的表达,从而对抗高糖对系膜细胞的损伤。2、脂联素可刺激系膜细胞AMPK通道开放,脂联素对HMCs的保护作用部分是通过脂联素受体介导AMPK信号通路实现的。第二章表达ADPN的pIRES2-EGFP-gAd质粒载体的构建及其在大鼠肾脏的表达目的:构建表达脂联素的pIRES2-EGFP-gAd质粒,观察其在大鼠肾脏的表达,为体内观察脂联素对糖尿病大鼠模型的肾脏影响奠定基础。方法:根据GENBANK中人脂联素的cDNA编码球形结构域(gAd)的序列设计引物,以已有的pET/gAd质粒(编码脂联素球形结构域的细菌表达质粒,gAd基因克隆于pET-15b载体的多克隆位点,长440bp)为模板,PCR扩增目的片段,连接T载体后转化大肠杆菌,用EcoRI和BamHI双酶切后,与pIRES2-EGFP荧光质粒连接,重组构建pIRES2-EGFP-gAd质粒。将构建成功的pIRES2-EGFP-gAd质粒采用脂质体介导经腹腔注射正常大鼠体内,然后在不同时间点(24h、48h、96h、7d)留取肾脏标本进行冰冻切片,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在肾组织中的表达情况,同时采用Western Blot检测肾皮质绿色荧光蛋白的表达。结果:1)重组构建的pIRES2-EGFP-gAd载体经双酶切电泳分析及DNA测序证实无碱基突变。2)在腹腔注射脂质体/pIRES2-EGFP-gAd转染复合物后24h,荧光显微镜下观察,即可在肾小球肾间质检测到绿色荧光蛋白的表达,在注射后48h荧光强度进一步增强,随着给药时间的延长,绿色荧光蛋白在肾脏的表达逐渐减少,在注射后第7d时,虽然仍能检测到绿色荧光蛋白的表达,但荧光强度明显减弱。Western Blot检测EGFP蛋白结果与冰冻组织切片结果一致。结论:脂质体能够介导pIRES2-EGFP-gAd真核载体在大鼠肾脏表达,实验中将能发出绿色荧光的EGFP报告基因融合在gAd基因的3’端,既保留了gAd的生物活性,又便于基因治疗中可检测到蛋白表达,为探讨脂联素在DN中的作用提供实验模型奠定基础。第三章复制DM模型研究脂联素对肾脏的保护作用及机制目的:研究脂联素对糖尿病大鼠的肾脏保护作用及其相关机制。方法:采用高糖高脂饮食配合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)的方法复制糖尿病大鼠模型。将32只Wistar大鼠随机分为正常对照组(NC组)、糖尿病组(DM组)、ADPN干扰组(DA组)和空载体转染组(DP),其中DA, DP组分别腹腔注射脂质体/pIRES2-EGFP-gAd或脂质体/pIRES2-EGFP复合物。处理8周后,观察血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)、24h尿微量白蛋白(UMA)变化;留取肾组织切片观察光镜下的病理改变并测定肾组织ROS释放量的变化;荧光定量RT-PCR检测各组大鼠肾组织eNOS、TGF-β1的基因转录水平,采用免疫组化法检测eNOS、TGF-β1、p-AMPK蛋白的表达水平。结果:与正常对照组比较,DM模型组大鼠UMA显著上升,肾组织ROS释放量增加(P<0.05),DM、DA、DP各组之间UMA无明显差异(P>0.05)。与DM组相比,DA组血糖和HbAlc有所下降,ROS释放明显减少(P<0.05)。光镜下DM组大鼠大部分肾小球系膜区增宽,基质大量增生,节段性基底膜增厚、部分肾小管上皮细胞空泡变性、脱落,肾小球内细胞数显著增多、单个核细胞浸润明显,与DM组相比,脂联素干预组以上病变均有减轻。与对照组相比DM组肾组织eNOS水平下降,TGF-β1表达明显上调,p-AMPK蛋白表达下调(p<0.05);脂联素干预组eNOS水平也有下降,但较DM组升高,TGF-β1水平较DM组下降(P<0.05),p-AMPK蛋白表达明显高于DM组(P<0.05)。结论:脂联素对糖尿病大鼠肾脏具有保护作用,其机制一方面通过刺激AMPK磷酸化,抑制ROS产生,减轻氧化应激反应,上调糖尿病大鼠肾组织中eNOS的表达,另一方面通过下调TGF-β1基因,减轻ECM在肾间质的堆积而实现的。