论文部分内容阅读
目的:卵巢癌是恶性程度极高的妇科肿瘤疾病,90%以上的卵巢癌均为上皮性卵巢癌。近年来,随着卵巢癌相关研究的发展,尽管有针对性的治疗上皮性卵巢癌的方法越来越进步,但大部分高级别浆液性卵巢癌（High grade serous ovarian cancer,HGSOC）患者在发病时已出现转移且复发率和死亡率极高。近年研究发现,肿瘤细胞的干细胞样特性是HGSOC生长和转移的重要原因。因此,阐明高级别浆液性卵巢癌细胞的干性特征的调控机制对研发新的卵巢癌治疗手段,延长患者预后具有重要意义。目前研究指出,富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体（Leucine-rich repeatcontaining G protein-coupled receptors,LGRs）家族成员及WNT通路在多种肿瘤发生发展中起到重要作用且能够调控肿瘤细胞干性特征。LGR4是一种G蛋白偶联受体,在某些人体器官中参与维持干细胞的自我更新和活性,但对于LGR4在高级别浆液性卵巢癌中的作用及机制未见报道,本研究通过检测LGR4在HGSOC的临床组织样本及细胞系的表达情况,研究LGR4对维持浆液性卵巢癌细胞上皮样干性的调控作用,进一步阐明LGR4调控浆液性卵巢癌细胞干性的分子机制,旨在为开发高级别浆液性卵巢癌的治疗手段提供新的方向及理论支撑。研究方法:1.检测LGR4在HGSOC临床样本中的表达情况:选择HGSOC组织29例、LGSOC组织5例及正常卵巢组织8例,采用免疫组织化学方法检测LGR4在临床样本中的表达情况及其表达与腹腔转移的相关性,并通过TCGA数据库分析LGR4在不同病理分级中的差异表达。通过CCLE数据库分析LGR4在不同卵巢癌细胞系中的mRNA水平,选择OVCAR3和CAOV3两种高级别浆液性卵巢癌细胞系,采用Real-time PCR的方法检测LGR4在两种细胞系中的mRNA水平。2.研究LGR4对高级别浆液性卵巢癌上皮样干性的调控作用:构建LGR4 shRNA慢病毒稳定转染的OVCAR3细胞系及LGR4过表达的CAOV3细胞系,通过Realtime PCR、Western blot、免疫荧光技术检测敲减效率及LGR4对上皮表型及干性特征相关标记物的影响;通过肿瘤球形成实验检测LGR4对高级别浆液性卵巢癌细胞干性的影响;流式细胞技术测定LGR4敲减后OVCAR3细胞ALDH1和CD133阳性细胞数的变化;采用CCK8及克隆形成实验检测LGR4对OVCAR3细胞增殖的影响;裸鼠皮下成瘤实验观察LGR4敲减后对OVCAR3细胞体内荷瘤和腹腔种植情况的影响。3.阐明LGR4调控高级别浆液性卵巢癌上皮样干性的作用机制:通过免疫组化实验及CCLE数据库分析确定LGR4与转录因子ELF3之间的关系;通过Western blot分析LGR4与ELF3之间的调控关系;采用Chip实验分析ELF3对LGR4的转录调控作用;构建ELF3 shRNA慢病毒稳定转染的OVCAR3细胞系,通过Real-time PCR、Western blot、免疫荧光技术检测敲减效率及ELF3对上皮表型及干性特征相关标记物的影响;通过肿瘤球形成实验检测ELF3对高级别浆液性卵巢癌细胞干性的影响;流式细胞技术测定ELF3敲减后OVCAR3细胞ALDH1和CD133阳性细胞数的变化;通过CCLE数据库分析、CO-IP实验、Western blot、Real-time PCR实验确定WNT通路对LGR4-ELF3轴的调控作用及LGR4、ELF3与WNT7B、FZD5之间的相关性;分别构建FZD5和WNT7B shRNA慢病毒稳定转染的OVCAR3细胞系,通过Real-time PCR、Western blot、免疫荧光技术分别检测细胞敲减效率及FZD5和WNT7B对上皮表型及干性特征相关标记物的影响;通过肿瘤球形成实验检测FZD5和WNT7B对高级别浆液性卵巢癌细胞干性的影响;流式细胞技术分别测定FZD5和WNT7B敲减后OVCAR3细胞ALDH1和CD133阳性细胞数的变化。结果:1.LGR4在高级别浆液性卵巢癌组织中高表达且与患者腹腔转移有关。TCGA数据库显示LGR4高表达与较高的病理分级（Grade 3+4）具有相关性。2.LGR4在不同卵巢癌细胞系中与上皮样表型相关因子呈正相关;构建LGR4shRNA慢病毒转染OVCAR3细胞系,LGR4的表达显著降低,E-cadherin的表达量也明显减少,而细胞内上皮样表型的负调控因子ZEB2的mRNA水平升高;构建LGR4过表达的CAOV3细胞系,LGR4的表达量显著升高,E-cadherin表达量升高,ZEB2的mRNA水平降低。3.LGR4敲减的OVCAR3细胞系中细胞干性相关因子POU5F1、SOX2、ALDH1A2、PROM1的表达量降低,ALDH1和CD133阳性细胞数减少且OVCAR3细胞的成球能力有所下降;而在CAOV3细胞系中,LGR4过表达后,POU5F1、SOX2、ALDH1A2、PROM1等细胞干性相关因子的表达量升高,肿瘤球形成能力增强。4.LGR4敲低的OVCAR3细胞系的细胞增殖能力和克隆形成能力均显著下降。5.利用LGR4 shRNA稳定转染OVCAR3细胞系成功构建裸鼠皮下荷瘤模型及腹腔种植模型,LGR4敲减组的小鼠肿瘤大小显著低于对照组,且腹腔中转移灶的个数也显著少于对照组;与对照组相比,LGR4敲减组小鼠肿瘤组织中的LGR4表达量显著降低,Ki-67的表达量也明显降低,而cleaved-caspase-3的表达量明显增加。6.在高级别浆液性卵巢癌临床样本中ELF3与LGR4的表达呈正相关,在不同卵巢癌细胞系中,ELF3与LGR4的表达量也存在线性关系。7.ELF3与LGR4启动子序列存在理论结合位点,Chip实验证实ELF3与LGR4启动子序列能够发生结合,ELF3转录调控LGR4。8.构建ELF3 shRNA慢病毒转染OVCAR3细胞系,ELF3的表达显著降低,Ecadherin的表达量也明显减少,而细胞内上皮样表型的负调控因子ZEB2的mRNA水平升高;构建ELF3过表达的CAOV3细胞系,ELF3的表达量显著升高,E-cadherin表达量升高,ZEB2的mRNA水平降低。ELF3敲减的OVCAR3细胞系中细胞干性相关因子POU5F1、SOX2、ALDH1A2、PROM1的表达量降低,ALDH1和CD133阳性细胞数减少且细胞成球能力下降;而在ELF3过表达的CAOV3细胞系中,细胞干性相关因子POU5F1、SOX2、ALDH1A2、PROM1的表达量升高,细胞的成球能力有所增强。9.在不同卵巢癌细胞系中,LGR4表达量与WNT7B和FZD5的表达量呈正相关,ELF3的表达量与WNT7B和FZD5的表达量同样呈正相关;在高级别浆液性卵巢癌OVCAR3细胞系中,FZD5与WNT7B能够相互结合,分别构建FZD5和WNT7B shRNA慢病毒转染OVCAR3细胞系,FZD5和WNT7B敲减后其表达量显著降低,且LGR4和ELF3的表达量也有所下降,表明WNT7B/FZD5能够调控LGR4-ELF3轴。10.构建FZD5 shRNA慢病毒转染OVCAR3细胞系,E-cadherin的表达量明显减少,而细胞内上皮样表型的负调控因子ZEB2的mRNA水平升高;FZD5敲减的OVCAR3细胞系中细胞干性相关因子POU5F1、SOX2、ALDH1A2、PROM1的表达量降低,ALDH1和CD133阳性细胞数减少且细胞成球能力显著下降。11.构建WNT7B shRNA慢病毒转染OVCAR3细胞系,E-cadherin的表达量明显减少,而细胞内上皮样表型的负调控因子ZEB2的mRNA水平升高;WNT7B敲低的OVCAR3细胞系中细胞干性相关因子POU5F1、SOX2、ALDH1A2、PROM1的表达量降低,ALDH1和CD133阳性细胞数减少且细胞成球能力显著下降。结论:1.LGR4在高级别浆液性卵巢癌组织中高表达且与腹腔转移相关。2.LGR4参与维持高级别浆液性卵巢癌细胞的上皮样表型及干性特征。3.LGR4诱导高级别浆液性卵巢癌细胞生长和腹腔转移。4.WNT7B/FZD5通过调控LGR4-ELF3轴参与维持高级别浆液性卵巢癌的上皮样干性特征。5.WNT7B/FZD5-LGR4-ELF3通路可作为防治高级别浆液性卵巢癌的一个靶点。