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寻找清洁可再生的石油替代能源是21世纪一个重要的研究发展方向。纤维素的微生物降解转化是生产清洁可再生生物燃料的理想手段。筛选新的具有优良性质的纤维素酶具有重要的生态学意义和生产应用价值。天然环境,尤其是微生物资源最丰富的土壤环境是筛选纤维素酶基因的重要来源,保存完好的长白山自然保护区是一个理想的土样样品采集地。利用同源扩增、TAIL-PCR等分子手段,我们对长白山森林土壤纤维素酶基因的多样性进行了研究,从中成功的筛选到了新的纤维素酶基因,并完成了异源表达和酶学性质检测,为纤维素酶结构与功能的研究提供了实验数据,为人们更好的改造和利用纤维素酶提供了必要的理论依据。本文取得具体实验结果如下:1.构建了长白山森林土壤GH7cbhI和GH48家族纤维素酶基因文库,并对这两个文库的基因多样性进行了研究。利用两对简并引物分别构建了长白山森林土壤GH7cbhI和GH48家族纤维素酶基因文库,并通过大量测序及系统发育分析获得了这两个家族的基因多样性情况。结果表明GH7cbhI家族文库基因多样性较高,序列相似度在99-38%之间,95%的基因序列与来自子囊菌门和担子菌门的非培养微生物基因序列相似度最高。GH48家族文库基因序列呈现“单极化”现象,即80%以上的序列都很保守,与来自Herpetosiphon aurantiacus的内切纤维素酶序列相似度最高。将这两个长白山土壤基因文库与其他报道的基因文库进行比较发现,长白山土壤文库基因多样性情况与玉米秸秆文库相似,与海洋沉积物文库存在差异。丰富的基因多样性也证明了长白山森林土壤是纤维素酶开发的理想资源库。2.利用同源扩增和TAIL-PCR等方法获得了多条GH48和GH5家族纤维素酶基因序列,并对其序列结构进行了分析。共克隆到2个GH48家族内切纤维素酶基因,6个GH5家族内切纤维素酶基因。利用同源扩增和TAIL-PCR方法,首次从天然土壤环境中克隆得到了GH48家族纤维素酶基因cel48hm01。该基因与Herpetosiphon aurantiacus的内切纤维素酶[WP012187855.1]相似度最高,达62%。cel48hm01基因蛋白序列包括一个CBM2结合结构域和一个GH48催化结构域;同时克隆了单结构域基因cel48hm02,其序列中仅含有一个GH48催化结构域。利用同源引物直接扩增的方法,从土壤样品基因组DNA中扩增得到了6个GH5家族内切纤维素酶基因:egl01、egl02、egl03、egl04、egl05、egl06。egl01基因较egl02基因在N端缺少了17个氨基酸的序列,但两者序列中均包含了N端催化结构域GH5和C端结合结构域CBM3;两者均与Bacillus licheniformis的内切纤维素酶序列相似度最高,分别达99%和100%。egl03、egl04、egl05和egl06四个基因与egl02基因存在一些氨基酸位点上的差异,与bacilluslicheniformis的内切纤维素酶序列相似度均为99%。这些基因的获得,为研究gh5家族纤维素酶蛋白结构与功能的关系提供了理想的天然突变体。3.首次表达和纯化了从土壤环境样品中直接克隆得到的gh48家族纤维素酶,并对重组酶进行了酶学性质检测和同源模建。本文首次对土壤样品直接克隆得到的gh48家族内切纤维素酶基因进行了原核表达和纯化。酶学性质检测发现重组酶cel48hm01/cel48hm02具有一定的嗜酸性和热稳定性,最适反应ph和最适反应温度分别为6.0,50℃;在ph8.0-10.0范围内及70℃下处理3h均能保持50%以上酶活。一定浓度的na+,k+,ca2+,fe3+等金属离子能够显著促进酶活,此外重组酶还具有较好的底物特异性。同源建模结果显示,重组酶cel48hm01/cel48hm02与clostridiumcellulolyticum的内切纤维素酶celf（pdb:1fbw）高级结构同源性在58%以上,且重组酶的gh48家族主要催化残基与模板一致。这表明重组酶可能也采用了梭菌属gh48纤维素酶的催化机制。以上研究结果为探讨gh48家族蛋白结构与功能的关系提供了实验数据支持。4.对gh5家族纤维素酶egl01进行了原核表达和性质检测,对其序列删减突变体的部分酶学性质进行了测定,并对egl01活性相关的关键氨基酸位点进行了定点突变研究。酶学性质检测结果表明,ph5.0,50℃条件下egl01活性最高,ph3.0-9.0,4-50℃条件下活性稳定。在金属离子,有机试剂,表面活性剂和高浓度盐离子等存在的条件下,egl01活性仍十分稳定。3mkcl和2mnacl分别使其酶活增加到135%和139%。此外,1-4mkcl/nacl6d条件下酶活仍保持在70%以上。egl01还具有较好的底物特异性,能水解羧甲基纤维素、榉木木聚糖、海带多糖、滤纸和结晶纤维素,表明其具有广泛的工业应用潜力。在对egl01序列进行分析的基础上,对其c端可能和嗜酸性相关的短肽以及和底物结合有关的cbm结构域进行了删减突变,结果显示“ngkliwgtepk”短肽删除后,突变体的嗜酸性与egl01相比并未发生明显改变,表明该短肽并非酶嗜酸性的直接结构基础。而cbm删减突变体在底物特异性上发生了显著变化,丧失了对不溶性底物的降解能力,证明cbm结构域的完整性对于egl01酶活具有的重要意义。对同源扩增获得的egl01天然突变体进行了表达和功能分析,发现其基本性质未发生明显改变,说明这些突变位点不是gh5家族纤维素酶活性的关键位点。通过与现有gh5家族纤维素酶的比对,确定了5个位于纤维素酶“凹槽”结构中可能与底物结合相关的关键氨基酸位点,定点突变的结果显示这些位点对酶活性具有重要作用,单个位点的变化即可造成酶活性的显著降低甚至丧失,这些结果为酶的改造及作用机制的研究提供了信息。