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本文主要研究了共代谢物—糖类和有机酸对Stenotrophomonas maltophilia CGMCC 1.1788代谢烟碱类杀虫剂吡虫啉(Imidaclpord,IMI)的代谢途径及其代谢机制影响。
在优化培养基中添加糖类和有机酸类作为碳源,与对照组相比,添加糖类可显著提高5-hydroxy IMI的产量,减少的IMI大多数或几乎全部都转化为5-hydroxy IMI,摩尔转化效率为80—100%;而以有机酸盐作为碳源,与对照组相比,5-hydroxy IMI产量基本没有增加(如琥珀酸和丙酮酸),有的反而减少(如柠檬酸和苹果酸);HPLC分析显示,除生成少量的5-hydroxy IMI外,代谢过程中还生成了另外一种代谢产物,即产物2。添加有机酸的实验组中约30—50%减少的IMI被转化为5-hydroxy IMI和产物2,其余的则被进一步降解为HPLC不能检测的产物。在LB培养基中添加柠檬酸、琥珀酸的钠盐以及淀粉,也存在上述现象。说明在S.maltophilia CGMCC 1.1788菌体培养转化IMI过程中,添加有机酸盐可以启动另外一条代谢途径。
在优化培养基中添加蛋白胨、牛肉膏、酵母膏等物质作为氮源,生长细胞培养转化,结果显示胰蛋白为最适生长氮源和最适羟基化酶活性氮源,生成5-hydroxy IMI量比对照组提高了近30倍。但未检测到上述另外一种产物的生成。
用5L发酵罐进行S.maltophilia CGMCC 1.1788菌株的菌体培养转化IMI,转化96h后,收取转化液。转化液先用1/3倍于转化液的二氯甲烷进行萃取去除底物,然后水相浓缩抽滤,以二氯甲烷:丙酮:甲醇=8:2:1为展层剂用TLC薄层分离产物,得到的两种产物的混合物再用制备型HPLC再次分离,最终纯度达到98.87%。产物晶体经质谱、红外光谱、核磁共振光谱分析,确定了该产物的分子结构为羰基化的吡虫啉(urea IMI)。Urea IMI浓度和的色谱峰面积之间呈线性关系,曲线为y=0.0625x+0.3948,相关系数为0.9996。
用triton X-100破除细胞膜,进行代谢途径定位分析,研究表明:在完整细胞、破膜细胞碎片实验组中减少的IMI的物质的量除了转化为urea IMI外,还由部分IMI被进一步降解掉了,底物与产物总的物质量与转化前的底物量相比明显减少:但细胞提取液实验组中虽然部分IMI转化为urea IMI,但转化前后总的吡虫啉及其衍生物的物质量并没有明显变化。实验说明IMI转化为urea IMI是由可溶性酶所组成,但urea IMI的进一步降解还需要其它膜蛋白的参与。添加在TCA循环中琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂丙二酸结果显示,丙二酸并没有抑制IMI转化为urea IMI,单独添加丙二酸能促进IMI转化为urea IMI,并且琥珀酸和丙二酸共同作用显示出明显的叠加效应。定量分析表明,经过96小时共代谢过程,反应液中琥珀酸的含量由起始的21.64g减少到19.73g,降低了约10%,而IMI对照组未能检测到琥珀酸的生成,进一步验证了琥珀酸是作为S.maltophilia CGMCC 1.1788代谢IMI的协同底物进行共代谢作用,促使了IMI代谢为中间产物urea IMI。