研究背景及目的急性呼吸窘迫综合症(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是一组由严重感染、创伤、误吸等非心源性因素引起的以进行性呼吸困难及顽固性低氧血症为临床表现的临床综合征,是呼吸科常见的急危重症,近十年来,其60天死亡率一直高达25%以上[2]。目前的研究表明其病理生理过程主要是血管内皮细胞和肺泡上皮细胞发生失控的炎症反应而导致细胞功能障碍[3],通透性增加,进而出现弥漫性肺间质及肺泡水肿。在细胞或组织损伤过程中,炎症与氧化应激是机体防御反应的重要组成部分,并且相互影响。炎症反应往往伴随氧自由基的生成,进而清除病原微生物,而氧自由基也可作为第二信使调节炎症反应。肺泡Ⅱ型上皮细胞作为肺泡上皮细胞的“干细胞”,具有增殖和分泌的功能,在肺部炎症及氧化应激过程中起重要作用,产生大量的促炎因子,如IL-8、TGF-β和TNF-α等[3]促发“瀑布式炎症级联反应”。其中,TNF-α是肺部炎症及氧化应激过程的主要促炎因子,在整个病理生理过程中诱导产生具有破坏病原微生物及第二信使功能的活性氧(reactive oxygen species,ROS), ROS进一步促进TNF-α的释放,如此不断正反馈,进而触发并放大下游一系列炎症氧化应激反应,氧化肺泡上皮细胞结构,破坏其细胞生理功能而介导细胞凋亡与坏死。本实验室前期研究表明,使用TNF受体-Fc融合蛋白(TNFR-Fc)能有效下调LPS诱导的炎症反应及氧化应激,从而减轻急性肺损伤小鼠的肺组织破坏[5]及细胞凋亡[6][9]。因此,研究肺泡上皮细胞炎症反应对继发的氧化应激损伤的调控作用,对于研究ARDS的病理生理学基础具有重要指导意义。在肺泡上皮细胞炎症氧化应激过程中,NADPH氧化酶(Nox)家族是产生ROS的重要来源,由Noxl-5及Duox1-2等亚型组成,各亚型的分布具有组织特异性,其中肺泡上皮细胞主要表达Noxl,刘珍[8]等人证明在TNF-α刺激下,A549细胞Noxl基因表达明显上调。所以,在肺泡上皮细胞研究Nox1基因的表达,对于进一步研究肺泡上皮细胞炎症氧化应激环路具有重要意义。本实验室前期研究表明,TNFR-Fc可通过降低LPS诱导的小鼠急性肺损伤模型中TNF-α浓度,控制TNF-a对炎症氧化应激的活化作用,并下调Nox1、Nox2、Nox4及XO等基因表达,减轻组织氧化损伤[9]。TNF-α刺激A549细胞可成功模拟体外肺泡上皮细胞炎症氧化应激模型,且沉默NF-κB p65基因可下调TNF-α诱导的肺泡上皮细胞的炎症反应及凋亡水平,且进一步研究表明,NF-K Bp65可结合至Nox1启动子片段,说明NF-K B p65对Nox1启动子具有调控作用。除NF-κB外,是否还有其他转录因子参与了ARDS过程中TNF-α对氧化相关基因Noxl的调控,从而启动了炎症诱导的氧化应激损伤过程,目前尚无明确定论。鉴此,我们从Nox1基因启动表达的开始环节——启动子的转录调控,对Nox1基因的表达进行研究。启动子(promoter)是RNA酶辨认、结合和启动下游基因转录的一段DNA序列,控制着基因的转录和表达强度。对于真核生物,启动子本身并不直接调控基因的转录翻译,而是通过与具有转录调控作用的蛋白质结合才能调控下游基因活动。故研究与启动子DNA结合的蛋白质,是了解目的基因转录调控机制的重要切入点。 Lambeth等研究表明Nox1基因转录起始位点上游4000余碱基的序列中包含IRSE、GAS、kappa B、GATA、C/ERB等转录因子结合位点,上述转录因子对Nox1转录有调节作用。因此,在炎症氧化应激细胞模型上研究Noxl启动子区的差异结合蛋白对研究Nox1通路的活化具有重要意义。目前对启动子结合蛋白的研究方法分为细胞内及细胞外方法。细胞内方法包括酵母单杂交技术、噬菌体表面展示技术等,是用已知的启动子序列筛选与其结合的蛋白编码基因,再通过生物信息学确定该蛋白质,具有可高通量筛选的特点,但特异性不高。细胞外方法包括凝胶阻滞实验、DNase I足迹试验等,是在体外用已重组构建好的蛋白质与启动子结合而验证该蛋白,特异性高,但效率低,操作复杂。鉴于目前对启动子结合蛋白研究方法所存在的问题,需要采用高通量及特异性高的方法进行Nox1启动子区差异结合蛋白的筛选,进一步阐明ARDS的病理生理机制。我们采用了生物素-链霉亲和素系统、双向荧光差异蛋白凝胶电泳和蛋白质质谱分析技术,对TNF-α刺激A549建立的细胞炎症氧化应激模型Nox1启动子区的差异结合蛋白进行筛选及鉴定,为后续研究Nox1转录调控机制的细胞信号转导通路提供实验基础,并对筛选出的蛋白质选择性进行初步的功能研究。研究方法：1.TNF-α刺激A549细胞Noxl启动子区差异结合蛋白的筛选1.1制备生物素标记Nox1启动子DNA探针本实验室保留的PGL3-Basic-Nox1重组质粒大肠杆菌菌种扩大培养后按说明书提取PGL3-Basic-Nox1重组质粒作为模板,生物素标记Nox1启动子上游引物5’端,PCR扩增末端带生物素的Noxl启动子探针,PCR产物行1%琼脂糖凝胶电泳,按琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒操作说明切胶回收Nox1启动子DNA探针。1.2 DNA pull-down实验将A549细胞以1.5×106接种于15cm细胞培养皿,待贴壁细胞融合至80%时更换为无血清培养基12h后,实验组细胞给予含TNF-α (10ng/ml)的无血清培养基、对照组给予等量无血清培养基继续培养,刺激1h后收集细胞沉淀按照胞浆、胞核蛋白抽提试剂盒说明书进行胞浆胞核蛋白抽提,按EttanTM 2D Quant Kit说明书测定核蛋白浓度。将两组核蛋白按Dynabeads(?) kilobase BINDERTM Kit说明书进行DNA pull-down实验,将细胞核蛋白Nox1启动子区结合蛋白洗脱。1.3双向荧光差异蛋白凝胶电泳(差异蛋白DIGE分离)细胞核蛋白进行荧光染料CyDye标记,上样到24cm pH 3-10 NL IPG干胶条,置入EttanTM IPGPhor进行第一向电泳后,取出IPG干胶条,平衡液平衡后放置于12.5%的聚丙烯酰胺凝胶上端,低熔点琼脂糖凝胶封胶后用EttanTM DALT Six电泳仪避光条件下进行恒定功率第二向电泳。上述用CyDye染色的凝胶为分析胶。用Typhoon Imager 9400成像仪对电泳后胶板图像扫描及成像,通过ImageQuant TL软件可以看到Cy2、Cy3以及Cy5的图像分别为蓝色、绿色及红色,分别代表内标蛋白、对照组Nox1启动子结合蛋白和刺激组Nox1启动子结合蛋白,Cy3和Cy5通道图像叠加后得到Overlay图像。1.4制备胶的制作、成像及差异蛋白分析、挖胶含有同等量各组样品蛋白混合后的样品加样到制备胶进行一向和二向电泳,具体步骤和参数与分析胶的制备要求相同。电泳结束后,固定、考马斯亮蓝G250染色液染色,Image Scanner对胶图进行扫描,得到制备胶的胶图。用DeCyder V6.5分析软件在分析胶中先进行胶内差异分析,再进行胶间差异分析,最后过滤平均体积差异大于1.5倍的蛋白点,对分析到的差异点在制备胶上匹配到相对应的蛋白点,最后利用EttanTM Spot picker全自动斑点切取系统进行挖胶。2.TNF-α刺激A549细胞Nox1启动子差异结合蛋白的质谱分析及生物信息学分析2.1质谱分析将差异蛋白点经胰酶消化等多步质谱鉴定前样品处理后,样品点靶输入ABI 4800 MALDI-TOF/TOF质谱仪中,获取肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprinting, PMF),采用MS和MS/MS联合模式搜索数据库Swiss-Prot,搜索物种为人。对结果按Mascot得分、匹配的片段数和覆盖率等进行综合判定。2.2生物信息学分析采用WoLF PSORT预测软件及参考Swiss-Prot及NCBI,对DIGE所筛选出的TNF-α刺激A549细胞Nox1启动子差异结合蛋白进行综合的亚细胞定位分析预测。应用String数据库对所鉴定出来的差异蛋白进行蛋白质一级相互作用预测。3. CSRP2对Nox1基因转录表达调控的初步研究3.1 pcDNA3-CSRP2-C-HA载体的构建体外培养A549细胞,提取总RNA, RT-PCR扩增CSRP2基因mRNACDS全长片段,通过分子克隆技术构建pcDNA3-CSRP2-HA载体。3.2细胞免疫荧光检测CSRP2细胞内定位A549细胞以1×105接种于24孔板,待长至80%融合时按Lipofectamine2000说明书进行pcDNA3-CSRP2-HA质粒转染,同时进行阴性对照转染；转染24h后给TNF-α刺激组以终浓度为lOng/ml的TNF-α培养基500 ul,对照组加入等量普通培养基,继续培养1h后进行免疫荧光染色,检测细胞免疫荧光。3.3荧光素酶报告基因检测CSRP2对Nox1基因转录表达的影响细胞培养同步骤3.2,待长至80%融合时按Lipofectamine 2000说明书进行pcDNA3-CSRP2-HA质粒、PGL3-Basic-Noxl质粒(实验室前期构建)共转染,同时进行阴性对照；转染24h后给TNF-α刺激组以终浓度为10ng/m 1的TNF-α培养基500 ul,对照组加入等量普通培养基,继续培养20h后检测荧光素酶活性。结果1. TNF-α刺激A549细胞Noxl启动子差异结合蛋白的筛选制备胶与分离胶蛋白质点匹配后,通过软件分析找到感兴趣的差异蛋白点(表达差异大于1.5倍)共24个,其中上调点23个,下调点1个。2. TNF-a刺激A549细胞Nox1启动子差异结合蛋白的质谱鉴定2.1 质谱鉴定通过质谱鉴定,从24个差异蛋白点中鉴定出13种蛋白质,分别为GLE1、 ALB、EXD2、KRT9、TTC34、KRT10、KRT1、DDX19A、GSTM5、GATC、 SSX11、H4、CSRP2,其中,KRT1和KRT10为同类蛋白质(角蛋白),胶粒724、725、727、742鉴定结果为蛋白质KRT9,胶粒728、741、745、754鉴定结果为蛋白质KRT10,胶粒1556、1591鉴定结果为蛋白质GSTM5,说明这些蛋白质在TNF-α刺激后发生了修饰的改变。2.2蛋白质亚细胞结构定位分析通过软件及数据库预测,鉴定出的13种蛋白质中,GLE1、EXD2、KRT9、 TTC34、KRT10、KRT1、DDX19A、GATC、Histone H4、CSRP2具有核定位信号。2.3蛋白质一级相互作用分析通过软件分析, KRT1、KRT9、ALB及 Histone H4之间存在相互作用关系,KRT10与GLE1之间存在相互关系。3. CSRP2对Nox1基因转录表达调控的初步研究3.1 pcDNA3-CSRP2-C-HA载体的构建通过测序鉴定, 证明pcDNA3-CSRP2-HA载体构建成功。3.2细胞免疫荧光检测CSRP2细胞内核定位静息状态下,CRP2在胞浆及胞核,但主要在细胞浆内分布,TNF-α刺激1h后,CSRP2浓聚于核膜,部分入核。3.3荧光素酶报告基因检测CSRP2对Nox1基因转录表达的影响经单因素方差分析,静息状态下,pcDNA3-CSRP2-C-HA转染组荧光素酶活性显著高于pcDNA3-C-HA转染组(F=21.114, P=0.006),经析因分析,TNF-α刺激后,荧光素酶活性显著升高(F=46.189, P=0.000); pcDNA3-CSRP2-HA转染组荧光素酶活性显著高于pcDNA3-HA转染组(F=26.868, P=0.000); TNF-α与质粒转染两种处理因素间有交互效应(F=5.447, P=0.042).结论1. GLE1、ALB、EXD2、KRT9、TTC34、KRT10、KRT1、DDX19A、GSTM5、 GATC、SSX11、H4、CSRP2等13种差异蛋白质可能直接／间接参与了]TNF-α诱导的A549细胞Nox1启动子转录活化过程；2.初步证明CSRP2具有转录调控活性,在TNF-α刺激下发生核转位,从胞浆进入胞核,并参与了Nox1基因启动子转录调控。