目的:全脱位牙外伤是指牙齿完全从牙槽窝中脱出,牙周膜和牙髓同时损伤,是牙外伤中最为严重的一种,约占恒牙外伤的16%。牙周膜在牙脱位时撕裂,随体外干燥环境保存时间增长,细胞逐渐脱水坏死。牙再植后,坏死的细胞不能发挥正常的再生功能。脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)作为新一代的种子细胞,与其他干细胞相比,在体外获取和培养上存在许多优势。大量研究也证明脂肪干细胞具有多向分化能力,能够向成脂、成骨等分化。正是由于具有这些优势,脂肪干细胞在很多领域作为种子细胞应用于组织工程中。富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)作为新一代富血小板浓缩物,其取自于自体血、制备简单,避免了伦理道德的争议及免疫排斥和血液交叉感染的风险;同时PRF中含有大量生长因子,有研究证实对ADSCs的增殖,分化具有促进作用,因此对脱位再植牙牙周修复再生提供了可能性。因此,本实验通过对PRF的制备与检测,将ADSCs作为种子细胞,并制备成细胞膜片形式,同时将PRF作为支架材料和生长因子的来源,构建ADSCs/PRF的复合体移植物,最大程度上促进牙周组织的修复与再生。在临床上,为保留脱位牙的牙周愈合提供新的思路和契机。方法:第一部分:PRF对脂肪干细胞生物学特性的影响1、PRF的制备及检测:抽取犬前肢静脉静脉血5ml,于离心机以400×g的转速离心10min,离心静置5min后获得中间层PRF膜片。将PRF膜片进行HE染色和扫描电镜观察,用于观察PRF的组织学形态。2、犬ADSCs的分离培养与鉴定:犬腹股沟处分离获得脂肪组织5ml,并通过酶消化法分离,培养出ADSCs,将传代培养的犬脂肪干细胞通过CCK-8检测脂肪干细胞的增殖活性,对其进行成骨,成脂,成软骨诱导等检测细胞的多向分化能力。3、脂肪干细胞复合PRF后成骨能力的相关检测:将培养的第三代脂肪干细胞采用不同成分的成骨培养基进行成骨诱导,PCR技术检测成骨相关基因ALP、Runx2的表达。ALP染色和茜素红染色等手段检测细胞矿化能力。第二部分:PRF复合脂肪干细胞膜片促进再植脱位牙牙周愈合的研究1、脂肪干细胞膜片的制备及检测:ADSCs细胞贴壁后加入成膜诱导液。培养约2周时形成脂肪干细胞膜片,并对膜片进行组织形态和超微结构观察。同时将剪碎的PRF与ADSCs膜片进行共培养,形成复合体,并对复合体进行超微结构观察。2、自体ADSCs膜片复合PRF促进脱位再植牙牙周愈合的研究:体外构建ADSCs/PRF复合物用于犬脱位牙的即刻与延迟再植中,观察移植物对牙周修复的效果。结果:第一部分:1、PRF膜片为三维立体的纤维蛋白网络结构,膜片上端为染色一致的纤维胶原蛋白结构,下端则为含有少量红细胞和部分蓝染细胞核的白细胞嵌入在纤维蛋白中。2、脂肪干细胞保持良好的细胞形态和扩增能力。茜素红染色后镜下可见明显的矿化结节形成,油红O染色后镜下可见细胞内大小不等的单个或融合呈串珠样结构的红色的脂滴形成。3、PRF能够诱导ADSCs进一步向成骨方向分化,并且,在早期成骨的过程中,随着诱导时间的增加,成骨基因的表达越来越明显。第二部分:1、细胞膜片中细胞规则排列,细胞外基质将细胞紧密连接在一起,细胞复层叠片状紧密排列,极性较一致;双膜复合体有着很好的结合2、即刻再植组中,ADSCs/PRF组的新骨形成量明显多于ADSCs组和PRF组,空白对照组无明显的新骨形成。ADSCs/PRF组中,牙周膜腔中可见牙周膜样组织的胶原纤维组织,少数牙根表面发生替代性吸收;延迟再植组中,牙槽骨中仍有新骨形成,但形成量较少。ADSCs/PRF组中有较少的纤维样组织形成,ADSCs和PRF组中出现了较为严重的替代性吸收,空白对照组可见的破骨细胞存在,吸收范围,陷窝大小均比其他实验组明显。结论:1.脂肪干细胞具有良好的增殖和分化。PRF能够明显促进细胞增殖及向骨方向分化。2.自体PRF局部应用于脱位牙再植,能明显促进脱位牙牙周愈合,但其修复效果与脱位时间呈负相关,即刻再植PRF组与延迟再植PRF的牙周愈合有明显的差别3.ADSCs/PRF双膜复合体较单纯的ADSCs膜片组和PRF组具有更强的形成牙周膜样组织的能力。同时,即刻再植组的脱位牙牙周愈合能力显著高于相对应的延迟再植组。