目的:胰腺癌是一种恶性程度高、早期诊断率低和死亡率较高的消化道恶性肿瘤,其发病率和死亡率近年来呈逐渐上升趋势。根据国际癌症研究机构发布的2020年全球癌症数据显示,2020年全球胰腺癌新发495773例,占新发肿瘤的2.6%,因胰腺导致死亡466003例,占新死亡病例的4.7%。由于胰腺癌细胞对化疗和放疗的敏感性较低,因此手术切除目前仍然被认为是治疗胰腺癌的主要手段,但是胰腺癌的术后复发率也较高,因此胰腺癌患者的整体预后仍然无明显改善。既往传统的肿瘤TNM分期方法仅仅依赖于患者最基本的临床信息和病理相关信息,或者结合患者的综合临床表现,大致估算患者的预期生存期,难以实现针对胰腺癌的个性化和精准治疗。临床上经典的肿瘤生物标志物CA19-9、CA125或CEA在胰腺癌的早期诊断和预后评估中的敏感度和精确度也难以满足精准医学的需要。因此,提高胰腺癌的早期诊断率和进一步建立胰腺癌相关新型风险评估模型将有助于指导胰腺癌的临床治疗决策的制定和提高患者的整体预后情况。既往多项基于不同组学数据的研究已经证实胰腺癌在分子层面存在具有显著差异的分子亚型,此外有研究显示肿瘤细胞和局部组织免疫微环境的相互作用在调节胰腺癌细胞的恶性生物学行为方面存在显著作用,进一步研究上述相互作用机制有助于理解免疫调节在胰腺癌进展中的机制,有助于进一步开发胰腺癌的免疫治疗方案,因此在本研究中我们尝试利用免疫相关基因识别并鉴定出新型胰腺癌相关分子亚型,为研究胰腺癌发生和发展的相关机制提供新的视角,并积极尝试构建预后预测模型,开发新型预后模型有助于协助评估胰腺癌患者的预后情况,帮助临床医生进行临床决策制定。TNNT（Troponin T）中文名为肌钙蛋白T,其分子量约为30-35k Da,含有约220-300个氨基酸,在横纹肌的收缩和舒张过程中发挥着重要的作用,在脊椎动物中,TNNT蛋白存在三种亚型,分别命名为TNNT1、TNNT2和TNNT3。既往多项研究结果显示TNNT1基因在多种人类疾病中发挥了重要的生物调节作用,例如在视网膜色素上皮细胞中过表达TNNT1基因可以促进细胞的迁移。在氯胺酮诱导神经精神障碍疾病小鼠模型的脑组织中可以检测到TNNT1基因表达上调。有临床研究显示TNNT1基因的多种突变与高密度脂蛋白（HDL-C）表达水平、冠心病和线状体肌病间存在显著相关性。在肿瘤研究领域,TNNT1在乳腺癌组织中显著高表达,且与乳腺癌患者的临床分期、T分期和N分期存在显著相关性,TNNT1基因过表达可以显著提高乳腺癌细胞的增殖能力。有研究显示TNNT1在结肠癌组织中显著高表达,且TNNT1基因高表达的患者预后较差,过表达TNNT1基因可以通过调节EMT过程进而促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭等恶性生物学行为。高表达TNNT1基因与恶性胸膜间皮瘤患者的预后存在显著相关性。上述研究结果显示TNNT1基因在多种恶性肿瘤中均存在促进作用,但是关于其在胰腺癌中是否存在生物学作用还未见文献报道,本研究拟进一步探索TNNT1在胰腺癌发生和发展中所起到的作用及其相关的分子信号通路。研究方法:1.从TCGA数据库获取胰腺癌相关的多组学数据并进行相应的预处理,利用Log-rank和COX生存分析鉴定出与胰腺癌预后显著相关的基因,利用免疫基因网站Imm Port提取出免疫相关基因的信息。将上述免疫基因与预后相关基因取交集,获得具有显著预后意义的免疫相关基因用于后续的共识聚类分析。利用共识聚类分析方法和预后相关免疫基因鉴定和识别出胰腺癌预后显著相关的分子亚型。利用GO、KEGG和GSEA富集分析方法,进一步鉴定与分子亚型相关的信号通路。利用免疫浸润和突变谱分析进一步描绘不同亚型间的分子特征。利用WGCNA分析方法鉴定出与上述分子亚型显著相关的基因集,并利用Cytoscape软件和Metascape数据库鉴定出上述基因集中的核心基因。利用LASSO回归模型构建基于免疫相关基因的预后评估模型,并利用ROC曲线检测上述模型在内部测试集和内部/外部验证集中的预后评估效能。利用单因素和多因素COX模型明确该预后评估模型是否可以作为一个独立的预后因素。2.通过收集并检测37例胰腺癌及癌旁组织标本中TNNT1基因的表达水平并进行差异统计分析。此外,本研究中检测了4种人源胰腺癌细胞系As PC-1、Capan-2、MIA Pa Ca-2和PANC-1以及人正常胰腺细胞系HPDE6-C7中TNNT1基因的表达水平。利用慢病毒转染技术构建了稳定敲减TNNT1基因的胰腺癌细胞系As PC-1和MIA Pa Ca-2。随后利用CCK8、单克隆形成实验、划痕和transwell实验检测稳定敲减TNNT1基因后,胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化情况。利用裸鼠皮下荷瘤模型进一步在在体情况下检测稳定敲减TNNT1基因后对胰腺癌进展的影响。3.利用TCGA数据库来源的胰腺癌组织测序数据进行生物信息学分析,推测TNNT1基因相关的信号通路。利用Western blot实验检测稳定敲减TNNT1基因的胰腺癌细胞系As PC-1和MIA Pa Ca-2中EMT和MEK/ERK/GSK-3β信号通路中关键分子的变化情况。为了明确TNNT1基因与MEK/ERK/GSK-3β信号通路之间的调控关系,本研究中设置了功能回复实验,共设计了三组,分别为阴性对照组、TNNT1基因过表达组和TNNT1基因过表达+U0126抑制剂组。结果:1.在本研究中为了建立胰腺癌免疫基因相关的分子亚型,首先从Imm Port数据库中提取了1811个公认的免疫相关基因。随后通过将TCGA数据库来源的基因表达数据和临床随访信息进行整合,利用Log-Rank和COX生存分析筛选出预后相关基因,在上述两种检验方法中P值均小于0.01的基因被认为是预后相关基因,取上述基因间的交集,最终获得了67个具有显著预后意义的免疫相关基因。随后基于共识聚类分析将所有胰腺癌样本聚类为两种分子亚型,分别命名为C1和C2,预后分析显示两组的预后存在显著差异。随后计算出上述两组分子亚型间的差异表达基因,最终得到了2698个差异表达基因,其中827个基因为上调基因,1871个基因为下调基因。随后基于上述差异表达基因,进行了GO、KEGG和GSEA通路富集分析,鉴定出多条与肿瘤发生和发展密切相关的信号通路。进一步的免疫浸润分析提示C2组的6种免疫细胞的浸润程度均高于C1亚型,其中macrophages、myeloid dendritic cells、T cells CD4+和T cells CD8+两组间的差异具有统计学意义,基于突变谱分析提示C1亚型的KRAS、TP53、RNF43、FLG、PCDH15和ADAMTS16突变频率要高于C2亚型,上述结果提示C1亚型的预后差可能与免疫抑制状态和癌症相关基因突变率高间存在相关性。利用WGCNA分析方法对上述2698个差异表达基因进行分析,从而寻找到与临床性状最为相关的基因模块,结果显示棕色基因模块与C1亚型、T分期和临床分期存在显著相关性,提示棕色模块基因可能与胰腺癌的进展存在一定相关性。利用Cytoscape软件和Metascape数据库进一步鉴定出棕色模块的核心基因。结合GEPIA数据库分析提示TNNT1、KCNN4、SH2D3A和PHLDA2基因在胰腺癌组织中较正常胰腺组织显著高表达。此外,预后分析显示上述4种基因表达量与胰腺癌患者的总生存期和无复发生存期存在显著相关性,且基因表达量越高,患者的总生存期和无复发生存期越短。利用LASSO回归分析对上述67个具有预后意义的免疫相关基因进行筛选,得到一个基于19个基因的预后评估模型,模型计算公式列举如下:风险评分=~1 ~9=1Coefficient*Expression of gene,利用风险评分公式计算出不同数据集中每位患者的风险评分,按照与中位值的比较,大于中位值的定义为高风险组,低于中位值的定义为低风险组,内部试验集、内部验证集和外部验证集中高风险组和低风险组间的预后分析显示高风险组的预后均差于低风险组,进一步利用ROC模型计算预后模型在不同数据集中的AUC曲线下面积,发现该预后模型在不同的数据集中均可以发挥较好的预测效能。随后对预后评估模型和常见的临床病理信息进行单因素COX回归分析,单因素COX分析结果显示预后模型、年龄、肿瘤分期、T分期和N分期可以作为胰腺癌的预后相关因素（P＜0.05）。进一步对上述预后相关因素进行多因素COX回归分析,结果提示预后模型和N分期可以作为胰腺癌的独立预后相关因素（P＜0.05）。2.利用Western blot和免疫组化实验检测37例胰腺癌组织及其对应癌旁组织中TNNT1基因的蛋白表达水平,结果显示胰腺癌组织中TNNT1基因的表达水平较癌旁组织显著提高。基于TCGA数据库来源的177例胰腺癌组织的TNNT1基因表达数据和相应的临床病理信息进行分析,结果显示高表达TNNT1基因的样本倾向于肿瘤的进展期。Western blot实验证实4种人源胰腺癌细胞系As PC-1、Capan-2、MIA Pa Ca-2和PANC-1中TNNT1基因的表达水平高于正常胰腺细胞系HPDE6-C7。此外,As PC-1和MIA Pa Ca-2细胞系中TNNT1基因的表达水平较高,因此我们基于上述两种细胞利用慢病毒转染技术构建稳定敲减TNNT1基因的细胞系,并用于后续的细胞功能实验。利用CCK8和单克隆形成实验证实稳定敲减TNNT1基因可以抑制胰腺癌细胞的增殖和单克隆形成能力。划痕实验和transwell实验结果也证实稳定敲减TNNT1基因可以抑制胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力。裸鼠皮下荷瘤模型结果证实在在体情况下敲减TNNT1基因表达后可以显著抑制胰腺癌的进展。上述实验结果提示TNNT1可以作为胰腺癌的潜在治疗靶点。3.基于TCGA数据库和GO/KEGG/GSEA通路富集分析预测TNNT1基因调控胰腺癌的相关分子机制,结果显示TNNT1基因与Epithelial Mesenchymal Transition、Apical Junction和MAPK等多种信号通路存在显著相关性。进一步结合细胞实验证实,稳定敲减TNNT1基因后,E-cadherin表达量显著上调,而N-cadherin、Vimentin、MMP9和Twist基因的表达量显著下调,上述结果显示敲减TNNT1基因后可以显著抑制胰腺癌细胞的上皮间质转化过程。此外,在As PC-1和MIA Pa Ca-2细胞系中稳定敲减TNNT1基因后,可以显著抑制P-MEK1/2、P-ERK1/2和P-GSK-3β蛋白的磷酸化水平,而MEK1/2、ERK1/2和GSK-3β表达量没有显著改变。进一步证实TNNT1基因通过相关信号通路进而调节胰腺癌细胞的恶性生物学行为,本研究中设置了功能回复实验,实验分为三组,分别为阴性对照组、TNNT1基因过表达组、TNNT1基因过表达+U0126抑制剂组。CCK8、单克隆形成实验、划痕实验和transwell实验显示过表达TNNT1可以显著提高胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而加入U0126抑制剂组可以部分消除TNNT1基因过表达带来的促进作用。利用WB实验检测三组间的TNNT1基因的表达情况,结果证实As PC-1和MIA Pa Ca-2细胞的TNNT1基因过表达组的TNNT1蛋白表达水平显著上调,而加入U0126抑制剂不影响TNNT1蛋白的表达水平。进一步检测两种细胞系中EMT相关关键蛋白的表达水平,实验结果提示在As PC-1和MIA Pa Ca-2细胞中过表达TNNT1基因可以促进N-cadherin和Vimentin表达量显著上调,而E-cadherin表达水平显著下调,加入U0126抑制剂后可以部分抑制TNNT1基因过表达带来的改变。此外,在本研究中进一步检测了ERK/GSK-3β信号通路中相关蛋白的变化情况,结果显示过表达TNNT1基因可以显著提高P-ERK1/2和P-GSK-3β蛋白的磷酸化水平,而ERK1/2和GSK-3β表达量无明显改变,同样地,加入U0126抑制剂后可以抑制TNNT1基因过表达带来的改变。上述实验结果证实TNNT1基因通过调节EMT过程和MEK/ERK/GSK-3β信号通路进而调节胰腺癌的恶性生物学行为。结论:1.本研究中基于共识聚类分析和免疫相关基因成功地识别和构建了胰腺癌特异性的预后相关分子亚型。利用亚型间的差异表达基因进行GO、KEGG和GSEA富集分析为进一步明确胰腺癌发生和发展的机制提供了新的视角。分子亚型间的免疫浸润、基因突变谱和临床特征对比分析,为分子亚型的预后差异提供了理论支持。利用WGCNA分析方法从亚型间的差异表达基因中鉴定出4种胰腺癌新型生物标志物,包括TNNT1、KCNN4、SH2D3A和PHLDA2基因。利用LASSO回归模型构建的19个免疫相关基因的胰腺癌预后预测模型可以用于评估胰腺癌患者的预后情况,协助临床医生进行临床决策制定。2.通过实验证实TNNT1基因在胰腺癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。临床相关性分析提示TNNT1基因高表达的胰腺癌患者倾向于肿瘤的中晚期,且TNNT1基因表达量高,患者预后差。利用细胞和动物实验证实在胰腺癌细胞中敲减TNNT1基因表达可以显著抑制胰腺癌细胞的恶性生物学行为,TNNT1可以成为胰腺癌潜在的治疗靶点。3.基于功能回复实验研究,证实TNNT1可以通过调控上皮间质转化过程和激活MEK/ERK/GSK-3β信号通路进而调节胰腺癌细胞的恶性生物学行为。