六种果蝇的Cecropin基因家族成员的筛查与分析

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Cecropin(天蚕素)是具有细胞溶解酶类的肽,是在1981年由Steiner与Boman等从用阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导的惜古比天蚕蛾(Hyalophoracecropia)蛹中分离鉴定的。在果蝇的抗菌肽多基因家族的研究中,Cecropin基因(Cec)家族引起了科学家的特别关注。在黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)中Cec基因家族的成员包括:功能基因(CecAl,CecA2,CecB和CecC)和假基因(CecΨ1和CecΨ2)。这些成员都是以紧凑的基因簇形式,位于D.melanogaster的3R染色体99E2位点上。这些基因家族成员中,CecAl,CecA2是编码同一种肽的,与CecA相比,CecB和CecC分别有5个和3个氨基酸残基的差异。CecAl,CecA2主要在果蝇的幼虫期与成虫期表达,而CecB、CecC主要在蛹期表达。这4个功能基因都包含有一个短的内含子序列和编码63个前体肽的序列。在进一步研究果蝇抗菌肽基因家族进化中发现了黑腹果蝇(D.melanogaster)的姐妹种D.simulans,D.mauritiana和D.sechellia中的CecA2丧失了功能,变成了假基因。然而,对其它物种的果蝇(如D.virilis,D.obscura和D.pseudoobacura)进行研究,发现它们基因组中Cec基因家族的成员的分布特征和进化趋势完全不同于D.melanogaster,呈现出显著的多样化特征。因此,在更多的果蝇物种中进行Cec基因家族的成员的研究,将阐明Cec基因家族的进化规律,并为由复制(duplication)的多基因家族的进化提供更充分的佐证。 本论文把Cec基因家族成员的筛查扩展到D.melanogaster种亚群(species-subgroup)以外的D.montium种亚群的物种中,得到了如下主要结果: 1.优化了筛查昆虫抗菌肽基因家族成员的策略,从RNA水平入手进行筛查,先获得家族成员的外显子序列之后,再从基因组层面入手获得内含子与其它调控序列的信息,了解它们的基因结构。 2.以D.melanogaster种群(species-group),D.montium种亚群D.kikkawai种组(species-complex)的两个分化枝(clade)的6个果蝇物种获得了32条与已知Cec基因家族成员序列相似的序列,除去怀疑是假基因的序列,剩下的30条序列可以分为四大类,分别为第1类、第1I类、第1IIa和IIIb类。其中第1类归为CecA,第1I类归为Ceca-like:第1IIa类归为CecC-like,第1IIb类归为CecC。发现在Ceca与CecC中存在着至少两个的成员,这是第一次在果蝇物种中发现的另一个CecC成员。从进化树的拓扑结构来看,第一次的基因复制事件发生在CecC类上,最后是CecA类与Ceca-like类的分化。 3.Cec家族成员编码的氨基酸及其密码子使用频率的分析结果显示,Cec家族成员以脂肪族的中性氨基酸为主,如丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、缬氨酸(V)。 4.根据天蚕蛾的Ceca成熟肽的结构模式(有发夹的简单的螺旋模式)和猪的CecropinP1成熟肽的结构模式(没有发夹的简单的螺旋模式)为基础,预测了D.kikkawai的CecC-like两种三维结构,并对它们进行了静电势分析,结果显示,既稳定而且有足够高的静电势的没有发夹的简单的螺旋模式可能比较接近真实的三维结构。 5.将三维结构和静电势的分析结合起来,探讨了各成员氨基酸残基的变异对结构与功能的关系的影响,发现CecC-like的半胱氨酸的存在可能影响该成员的抑菌特点。 本论文的研究结果,为Cec基因家族成员在D.montium种亚群的物种中的筛查奠定了基础,从新发现的另一个CecC成员以及其他成员的特征,充分显示了D.montium种亚群物种中Cec基因家族成员与已知Cec基因家族成员的多样性和相似性。本论文将分子进化与功能进化结合起来,这将扩展编码有生物活性的基因进化的研究领域,对抗菌肽多基因家族的进化研究有着重要的意义。
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