在养殖业快速发展的过程中,饲用抗生素滥用问题突出。近年来,抗生素在畜牧养殖和动物医疗中的滥用现象得到重视。我国农业农村部明确规定2020年起饲料中全面禁止添加抗生素,随着饲料替抗政策正式全面实施,具有替抗作用的功能性饲料添加剂需求爆发,研发抗生素替代品成为研究热点。猪β-防御素-1（Porcineβ-defensin-1,PBD-1）具有来源动物本身,安全稳定,有广泛的生物学活性、特殊的抗菌机制、不易产生药物残留及耐药性等特点,是具有研发前景的绿色抗生素替代品之一。乳酸菌在研究报道中是最常用的益生菌,能够有效抑制肠道病原菌的侵袭,具备替代抗生素产品的潜能。研究表明乳酸菌和防御素均可以增强机体免疫力,促进生长。但乳酸菌与防御素抑菌促生长机制并不相同,通过口服联合应用是否存在协同效应的相关研究未见报道。本实验旨在表达出PBD-1多肽并制备成猪只可食用制剂,确定安全后使其与实验室分离保存的性能已知的猪源乳酸菌复配,对PBD-1多肽与乳酸菌复合制剂进行功能评价,为防御素与乳酸菌兽用饲料添加无抗配方提供依据。具体研究方法如下:1.重组猪β-防御素-1（PBD-1）蛋白的制备及安全性评价通过在Genbank上搜索PBD-1基因序列优化后合成,构建p ET-32a-PBD-1重组表达载体并将其转化至E.coli BL21（DE3）p Lys S感受态细胞中诱导重组质粒的表达,用SDS-PAGE及Western blot对蛋白进行验证后利用镍柱将蛋白纯化得到提纯的PBD-1多肽,利用透析袋和超滤管脱盐浓缩调整纯化后的重组蛋白的浓度约为1.0μg/μL。采用琼脂孔穴扩散法及MIC法对纯化后的重组蛋白体外抑菌活性评价。然后用锐孔凝固浴法将PBD-1制成微胶囊并进行体外释放试验以测试其在体内的释放情况,根据动物用转基因微生物安全评价指南通过对小鼠饲喂PBD-1微囊制剂后是否产生病变进行生物安全评价。结果显示:（1）成功构建出p ET-32a-PBD-1重组表达载体,经诱导纯化得到大小约为24 k D的重组蛋白PBD-1。（2）体外抑菌实验显示PBD-1多肽具有一定的广谱抑菌活性,成功将其制备成微胶囊且微胶囊在模拟胃肠液的释放情况良好。（3）通过动物实验,饲喂制备的重组PBD-1多肽微胶囊的小鼠增重明显,解剖无病变,各脏器切片无明显感染现象,表明制备的PBD-1微胶囊对动物体安全无危害。2.猪β-防御素与猪源乳酸菌复合制剂的制备将实验室保存的猪源乳杆菌动物乳杆菌T20划线活化增值,通过PCR核酸验证测序无误后,测定乳酸菌的生长曲线,通过琼脂孔穴扩散法及MIC法验证其抑菌活性。将乳酸菌与PBD-1多肽共培养探查PBD-1对乳酸菌的生长是否存在抑制作用,将不同配比的乳酸菌及PBD-1多肽发酵24 h,通过将发酵后上清液进行琼脂孔穴扩散抑菌实验计算得到最佳配比制剂。结果显示:（1）通过测序鉴定乳酸菌为动物乳杆菌。（2）乳酸菌抑菌实验显示乳酸菌对5种病原菌均具有较强的抑菌活性。（3）PBD-1与乳酸菌共培养实验显示PBD-1几乎不抑制乳酸菌的生长。（4）琼脂孔穴抑菌实验显示当PBD-1多肽:乳酸菌为1:1时抑菌效果较好,PBD-1与乳酸菌复配后的发酵液抑菌活性具有一定的协同效应。3.猪β-防御素与猪源乳酸菌复合制剂的功能评价将复合制剂乳酸菌及PBD-1微囊分别饲喂小鼠20 d,通过对小鼠生长性能、免疫器官指数、肠道菌群、小肠切片进行综合评价,对复配制剂进行效果评价。结果显示:（1）在生产性能方面,PBD-1、乳酸菌与复合制剂均能提高采食量和增重,且料肉比有所降低,添加复合制剂比单独添加乳酸菌或PBD-1微囊制剂的生产性能更好。（2）免疫器官指数方面,处理组均表现出了比对照组高的趋势,且复合制剂组免疫器官指数更高,表明PBD-1与乳酸菌在提高小鼠免疫力方面均有促进意义。（3）在肠道菌群方面结果显示PBD-1微胶囊组肠道菌群结构与对照组无明显差异,乳酸菌组与复配组乳酸菌比例升高,且复配组乳酸菌比例更高。表明乳酸菌能改善肠道菌群而PBD-1不能改善肠道菌群,但是PBD-1多肽与乳酸菌复配具有一定的协同效应。（4）在肠道组织切片方面,各组长绒毛结构完整,PBD-1微胶囊组、乳酸菌组与复配组杯状细胞较对照组多且基底层结构清晰柱状细胞密集排列,纹状缘结构清晰,黏膜屏障良好。表明PBD-1与乳酸菌均能促进小鼠消化,提高小鼠免疫。综上,本研究基于表达纯化的重组PBD-1及临床分离的乳酸菌T20成功制备了复合制剂,经动物实验初步评价了复合微生态制剂对小鼠生长性能效果良好。为研发临床可用的饲用抗生素替代品提供依据。