猪圆环病毒2型Cap基因在大肠杆菌中的可溶性表达与免疫特性研究

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猪圆环病毒2型(PCV2)能够引起猪的全身性疾病,临床典型症状有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合症(PDNS)、繁殖障碍等,统称为猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)。在临床上的PCVAD,能够与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体、猪流感等其他细菌性病原继发或混合感染猪体,严重危害世界养猪业的发展。PCV2是自然界已知的最小动物病毒,其基因组ORF2编码的Cap蛋白是PCV2的主要结构蛋白和免疫原性蛋白,是研制PCV2基因工程疫苗的主要靶基因。目前,虽然在国内实现了 PCV2灭活疫苗的商品化生产,亚单位疫苗研究也有一定突破,但是依然存在着诸多限制因素。本研究尝试用大肠杆菌可溶性表达PCV2 Cap蛋白,为开发高效廉价的新型基因工程疫苗奠定了基础。具体研究内容如下:1.猪圆环病毒2型Cap蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达将PCV2 Cap基因的密码子改造为大肠杆菌偏爱的密码子,以改造后的Cap基因(Capm)为模板,利用PCR方法分别克隆至表达载体pRSETB、pET28a和pET32a,再转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示,pRSET-Capm、pET28a-Capm和pET32a-Capm均可成功表达Cap蛋白,并且大部分蛋白都能够以可溶性形式存在于上清,Western-Blot和PCV2夹心ELISA结果显示,三种重组蛋白均能够与特异性的PCV2单克隆抗体结合,表明本研究优化的密码子有益于Cap蛋白在大肠杆菌中的分泌表达,重组蛋白具有PCV2的抗原特性,为PCV2抗原制备和亚单位疫苗研制奠定了重要基础。2.猪圆环病毒2型Cap-生长抑素融合蛋白原核表达与免疫特性研究本研究以PCV2SH株密码子优化后的Cap基因(Capm)为模板,在其3’端插入生长抑素基因(SS),再克隆至大肠杆菌表达载体pRSETB、pET28a和pET32a。再转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。SDS-PAGE结果显示,大肠杆菌表达的融合蛋白能够以可溶性形式存在。Western-Blot结果显示融合蛋白不仅能够与PCV2单克隆抗体结合,而且能够与抗SS抗体反应,呈现特异性条带。将pET28a-Capm-SS融合蛋白与佐剂ISA206混合配制疫苗,免疫小鼠的血清内能够检测到高水平的PCV2特异性ELISA抗体,首免后14d和42d,pET28a-Capm-SS免疫组小鼠日增重明显高于其余各组(P<0.05),表现出较好的促生长效果。攻毒试验结果显示,各免疫组脾脏中PCV2含量都显著低于非免疫对照组(P<0.01),表明两种重组蛋白与佐剂ISA206制成的疫苗可诱导机体产生良好的免疫保护作用,从而抵抗PCV2的感染,为PCV2亚单位疫苗的研制提供了新思路。3.不同佐剂对猪圆环病毒2型重组Cap蛋白免疫特性的影响本研究采用大肠杆菌表达的重组Cap蛋白28a-Capm和MrCap及杆状病毒表达的重组Cap蛋白TAT-rBCap,分别与GEL01、ISA206、ISA15A和CPH四种佐剂混合,配制成9种疫苗,进行免疫小鼠保护试验,结果显示,所有免疫组免疫后21d和42d,均可检测到高水平的PCV2特异性ELIS A抗体,但不同蛋白抗原与佐剂的适配性不同。对于28a-Capm和MrCap,GEL01佐剂效果最好;对于TAT-rBCap,CPH佐剂效果最佳,而ISA15A佐剂/三种重组蛋白疫苗免疫组ELISA抗体水平较低。PCV2中和抗体检测结果显示,TAT-rBCap + GEL01疫苗免疫组效果最佳,中和抗体效价达1:50。攻毒后21d取出脾脏,采用荧光定量PCR检测PCV2核酸,结果显示,28a-Capm和MrCap与佐剂GEL01和ISA206制成的疫苗免疫组PCV2含量显著低于非免疫对照组(P<0.05),TAT-rBCap抗原疫苗免疫组PCV2含量显著低于非免疫对照组(P<0.05),证明GEL01和ISA206佐剂与28a-Capm、MrCap和TAT-rBCap三种重组蛋白配置的疫苗均具有较好免疫保护作用,从而为PCV2亚单位疫苗的研制奠定了基础。
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