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血管生成是组织利用既存血管产生新血管的过程。肿瘤新生血管生成是肿瘤组织在其生长过程中诱导的新血管生成。20世纪70年代，学者Folkman提出假说，认为肿瘤的生长和转移与肿瘤新生血管的生成有关，破坏或抑制肿瘤新生血管生成能有效的抑制肿瘤的生长和转移。人纤溶酶原Kringle 5（简称hK5）是纤溶酶原中与血管抑素（Angiostatin）相连的第5个联环区，它能通过抑制血管内皮细胞增殖和迁移，以及诱导内皮细胞凋亡来抑制肿瘤新生血管生成，是一种新发现的活性较强的肿瘤新生血管生成抑制剂。本研究中采用的是毕赤酵母系统表达的重组人纤溶酶原Kringle 5（简称rhK5），它由98个氨基酸残基组成，包含3对二硫键，5个游离氨基，分子量约为17.5kD。目前，国内同类产品内皮抑素（endostatin）已成功上市，该类产品体内半衰期较短，临床需要频繁给药，结果导致患者的临床依从性较差。因此本课题对rhK5的长效形式进行研究，同时这也是目前重组蛋白和多肽类药物二次研发的一个方向。重组蛋白类药物的长效修饰手段主要包括重组DNA修饰、聚乙二醇（简称PEG）修饰和缓释制剂技术三种。PEG修饰起源于20世纪70年代，属于蛋白质体外化学修饰，是当前一种成熟且简单易行的长效修饰手段，它通过改变母体蛋白分子的理化性质（分子量增加、等电点降低、稳定性增加）和免疫学性质（免疫原性和免疫反应性降低）来改善其体内药代动力学性质，从而能达到在降低给药频率的情况下获得相同甚至改善的体内药效学性质。本课题首先选择了目前常用的三种不同类型的活化PEG(mPEG-SPA20kD、mPEG2-NHS20kD、mPEG2-NHS40kD)对rhK5进行修饰，通过离子交换等方式的纯化获得单修饰PEG-rhK5；然后利用体内抑瘤实验从三种单修饰PEG-rhK5中筛选出一种抑瘤效果较好的修饰物：mPEG-SPA20kD-rhK5；最后对该种修饰物的理化性质和抑瘤效果进行了较为细致的考察。在第一部分研究中，从反应体系pH值、PEG与rhK5的投料比、反应温度、反应时间、蛋白浓度5个方面对三种PEG的修饰条件进行了初步优化，使用弱阳离子交换色谱分别获得了三种单修饰PEG-rhK5，并对其进行了SDS-PAGE纯度分析和碘染-考染-免疫印迹联合确证实验，为后面的实验提供了可靠的物质基础。在第二部分研究中，我们首先验证了Lowry和BCA两种蛋白含量测定方法不受PEG修饰干扰，确保了三种PEG-rhK5和rhK5在蛋白给药剂量上可比性；然后测定了三种单修饰PEG-rhK5和rhK5的小鼠肌肉、腹腔两种给药途径血药浓度变化并得出结果：与rhK5相比，三种单修饰PEG-rhK5能够在较高的浓度维持较长的时间，为抑瘤实验中三种单修饰PEG-rhK5的给药间隔提供了实验支持；最后选择Lewis肺癌、H22肝癌两种小鼠肿瘤模型和肌肉、腹腔两种给药途径进行了初步抑瘤实验，实验设计方案：rhK5和三种单修饰PEG-rhK5的给药总蛋白剂量相同，三种单修饰PEG-rhK5较rhK5的给药频率降低。在Lewis肺癌的肌肉给药途径中，rhK5、mPEG-SPA20kD-rhK5、mPEG2-NHS20kD-rhK5、mPEG2-NHS40kD-rhK5的抑瘤率分别为9％、27％、8％、13％；在H22肝癌的肌肉给药途径中，相应的抑瘤率分别为14.2％、57.5％、17.2％、19.2％，两种肿瘤模型和两种给药途径均提示mPEG-SPA20kD-rhK5的抑瘤效果要优于另外两种修饰物，因此本实验中选择PEG-SPA20kD-rhK5进行进一步研究。在第三部分研究中，首先对mPEG-SPA20kD-rhK5进行了质量控制要点研究，包括分子量、等电点、纯度、残留PEG、残留rhK5、紫外光谱扫描和圆二色谱，结果表明：PEG修饰使rhK5分子量增加、等电点降低，对rhK5的紫外光谱和圆二色谱未产生明显影响，纯度、残留PEG、残留rhK5符合要求；然后使用鸡胚尿囊膜新生血管生成抑制实验考察了mPEG-SPA20kD-rhK5的体外生物学活性，结果表明mPEG-SPA20KD-rhK5具有抑制新生血管生成的活性；接下来利用H22肝癌模型，通过静脉给药方式，在总蛋白给药剂量相同，修饰物给药频率降低的情况下，设置了高、中、低三个剂量组对PEG-SPA20kD-rhK5和rhK5进行了抑瘤实验，PEG-SPA20kD-rhK5三个剂量组（20mg／kg、10mg／kg、5mg／kg）的抑瘤率分别为55.0％、63.5％、40.6％，rhK5三个剂量组（10mg／kg、5mg／kg、2.5mg／kg）的抑瘤率分别为60.0％、63.5％、65.3％，但统计结果说明相同给药剂量的PEG-SPA20kD-rhK5和rhK5的抑瘤效果无明显差异，这表明PEG修饰起到了降低给药频率的作用，同时利用免疫组化和ELISA测定探讨了PEG-SPA20kD-rhK5和rhK5在肿瘤组织中的分布情况，通过肿瘤微血管密度和细胞凋亡实验初步探讨了rhK5的作用机理，结果表明：PEG修饰更有利于rhK5在肿瘤组织的分布且分布范围广，在肿瘤微血管密度和细胞凋亡两个方面未对rhK5产生明显影响。