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目的:本研究通过制备清道夫受体启动子连接兔基质金属蛋白酶9(Matrixmetalloproteinase 9 MMP9)的结构基因,应用原核显微注射技术来制作巨噬细胞特异性表达MMP9的转基因家兔模型来研究动脉粥样硬化疾病的发生。通过体内实验分析巨噬细胞由来的MMP9在动脉硬化斑块形成及发展病理过程中的作用。体外实验观察在MMP9过表达的HepG2细胞内,前蛋白转化酶枯草溶菌素 9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type9,PCSK9),低密度脂蛋白受体(Low density lipoprotein Receptor,LDLR)基因表达的变化水平,揭示MMP9,PCSK9和LDLR三者之间的相互作用关系以及它们对脂质代谢的影响。方法:本研究将日本大耳白兔的MMP9 cDNA导入含有清道夫受体启动子的pAL-1载体内,并在结构两端安插绝缘子,使其不受插入染色体位置的影响,在动物体内得到稳定的巨噬细胞特异性MMP9的高表达。将构建好的MMP9基因直接注射到受精卵的雄原核内,然后将带有MMP9基因的受精卵移植到同品系假孕受体雌兔的输卵管中,获得新生转基因仔兔,筛选子一代中转基因雄兔作为精子供体兔,用于繁殖。新生转基因家兔满4个月后全日对其提供0.3%胆固醇添加饲料,持续16周,后将其大动脉及心脏全部分离摘出后用10%中性福尔马林固定,采用HE染色观察大动脉和冠状动脉病理学变化及分子与蛋白水平变化。体外实验采用带有MMP9基因的慢病毒包装质粒转染HepG2细胞,建立MMP9过表达稳转细胞系。实验分组设置对照组、实验组。根据细胞中MMP9基因的荧光表达情况,选择最适转染病毒浓度。RT-PCR,Western Blot进一步验证MMP9 mRNA表达水平和蛋白表达水平。嘌呤霉素5μg/μL浓度筛选2周,保种成功传代的细胞。造模成功后,检测过表达MMP9的HepG2细胞中PCSK9、LDLR在蛋白水平和mRNA水平的表达情况。结果:通过比较高胆固醇负荷饮食喂养的转基因家兔与非转基因家兔,血中低密度脂蛋白,甘油三酯和高密度脂蛋白无显著差异,同时主动脉处动脉硬化斑块面积及位置也无明显差异,进一步病理学分析发现转基因组家兔内膜病变处出现大量钙盐沉积,并伴随不稳定斑块形成。免疫组化染色病理分析动脉病变内部观察到,与非转基因家兔相比,转基因家兔内膜聚集更多富集脂质的泡沫细胞。对冠状动脉分析结果显示,相比较非转基因家兔,转基因家兔冠状动脉斑块表现出与主动脉类似的结果,富集更多巨噬细胞以及出现钙盐沉积。同时发现在转基因家兔主动脉弓部MMP-2,MMP-12以及TIMP-1和TIMP-2蛋白表达增多。体外实验结果显示,带有MMP9基因的慢病毒包装质粒成功转染HepG2细胞,建立了 MMP9过表达的稳转细胞系。MMP9基因过表达后,PCSK9在蛋白水平和mRNA水平均呈现下调趋势。而LDLR在mRNA水平呈现上调趋势,LDLR蛋白水平未出现显著的统计学差异。结论:动脉粥样硬化的发生与MMP9过表达密切相关。一方面,巨噬细胞源性的MMP9增多促进了动脉粥样硬化进展期病变的形成,同时促进了血管钙化的发生;另一方面,细胞过表达MMP9基因,下调了 PCSK9基因水平进而影响LDLR表达水平,并可能影响脂质代谢进程。