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以水稻(Oryza sativa L.)精细胞与二细胞花粉差减文库中得到的在精细胞中优势表达的克隆作为探针,筛选水稻精细胞cDNA文库,得到对应的两个全长cDNA克隆。分析表明两个全长cDNA阳性克隆长度分别为2278bp和2437bp,共同拥有一个由579个氨基酸组成的开放读码框,分子量为66.7kDa,等电点为4.885。在GenBank中比较显示与拟南芥的肌球重链蛋白有一定的同源性(46%),并具有肌球蛋白特征的结构域。用RT-PCR方法进行检测分析表明此基因在叶、花粉母细胞期幼穗、单细胞花粉、二细胞花粉、成熟花粉、授粉子房和精细胞中均有表达,但在精细胞中表达量远远高于其它组织细胞,证明此基因是在水稻精细胞中优势表达的。 把RSSG58基因开放编码框连接到表达载体pQE30上,重组质粒在E.coliM15中表达出了N端融合了6×His的融合蛋白。分离纯化融合蛋白来免疫家兔,制得了高效价、高特异性的多克隆抗体。Western杂交和免疫组织化学显示在精细胞内的蛋白表达量很高,成熟花粉和二细胞中有微弱表达,在单细胞花粉和花粉母细胞期没有杂交信号,肯定了RSSG58基因在精细胞中的优势表达。 根据公布的水稻基因组测序的比较和水稻精细胞优势表达的RSSG58基因cDNA序列,用PCR方法克隆出RSSG58在起始密码子以前的上游调控序列Pr58。对Pr58启动子进行了鉴定和分析表明具备大多数高等植物启动子的保守元件。将RSSG58基因5′侧翼序列做缺失片段分析,从Pr58中通过PCR得到三个不同大小两端带有Hind Ⅲ、BamH Ⅰ酶切位点的片段Pr58 Ⅰ,Pr58Ⅱ和Pr58Ⅲ,定向插入载体pMGFP4(pBI221改建),取代原有的CaMV35S启动子,报告基因为绿色荧光蛋白(GFP),构建了驱动报告基因GFP的植物表达载体pRGFP,pRGFPll和 pRGFPlll。为进一步在模式植物中研究其表达功能奠定了基础。 利用RNA原位杂交技术,地高辛RNA标记试剂盒体外转录方法标记RSSG58反义探针,研究了水稻花药发育过程中RSSG58mRNA时空表达特点。表达水平有明显的时空差异,花药发育早期,包括花粉母细胞期、四分体期RSSG58mRNA均未能检测到杂交信号。杂交信号在单细胞花粉期开始有微弱信号,随着花粉成熟,杂交信号强度增加;当进入花粉成熟态时,花粉精细胞中表达量达到最高水平。 为了进一步探索 RSSG58基因功能,以 RSSG58 CDNA为模板,采用 RT-PCR和酶切方法得到 cDNA片段,反向插入表达载体pFGC5941中,构建了可在植物中调控表达反义RNA基因片段的反义重组表达载体。以根癌农杆菌浸渍法侵染拟南芥植株花蕾,将反义片段整合到拟南芥植株中。研究发现表达了反义RSSG58基因植株的后代花粉形态有皱缩现象,花粉的生活力下降,结实少。细胞学观察反义植株在花粉母细胞期、四分体期、和单细胞花粉期的结构都无异常,在二核期和成熟花粉期出现异常结构,如出现大的液泡,细胞质浓缩,或出现空的花粉。由此可以推测RSSG58基因对花粉的发育起重要作用。