论文部分内容阅读
[背景和目的]脊髓损伤导致神经功能严重障碍,哺乳动物脊髓神经再生一直是世界性的难题,神经不能重新生长并与其下一级神经元形成有效的突触联系,往往归因于脊髓损伤后形成的空洞及其堆积的星型胶质细胞阻碍了神经的再生以及中枢神经本身再生能力较差等原因。基因修饰的干细胞移植治疗脊髓损伤在很多试验中都表现出很大的潜能,其中以骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal cell, BMSC)具备来源广、增殖快等特点而备受研究者们的青睐。富血小板血浆中含有大量的生长因子,如血小板衍生生长因子(PDGF),转化生长因子-p(TGF-β),类胰岛素生长因子(IGF),表皮生长因子(EGF),血管内皮生长因子(VEGF)等,这些生长因子对神经的再生都有一定的作用。脑源性神经生长因子(Brain-derived neutrophic factor, BDNF)已被证实有促进皮质脊髓束神经再生的作用,PRP和BDNF共同作用被证实能诱导BMSC向神经元形态方向分化。PRP和BMSC在修复急性面神经损伤时具有协同作用。我们通过体外实验来证明PRP能否诱导BDNF修饰的骨髓间充质干细胞向神经元方向分化,以及在大鼠半横断脊髓损伤模型中联合BDNF修饰的骨髓间充质干细胞和PRP移植治疗后的效果。利用介导BDNF的腺病毒转染骨髓间充质干细胞后,将转染目的基因的BMSC与富血小板血浆(Platelet-rich plasma, PRP)混合后分别进行体外和体内实验,以探讨PRP与BDNF-MSC在脊髓损伤修复中的作用。[方法]：体外实验：3×105BMSC或BDNF-MSC与10μl PRP共培养14天,对照组单纯MSC培养；体内实验：1×106BMSC或BDNF-MSC与10μl PRP,充分混合后移植到脊髓半横断的SD大鼠中,对照组为单纯PRP、单纯MSC和BDNF-MSC移植。采用BBB (Basso-Beattie-Bresnahan)评分法分别在术后1天、7天、14天、21天、28天、56天对各组大鼠患肢进行功能评分。术后1周、4周和8周测定各组大鼠脊髓损伤区域BDNF的表达量,术后4、8周用realtime-PCR和western blot测定总的神经丝-200(neurofilament-200, NF-200)、胶质酸性纤维蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)的表达量,免疫组织化学检测脊髓损伤区域GFAP和5-HT的表达。[结果]：PRP与BDNF修饰的骨髓间充质干细胞共培养后BMSC在NF-200,GFAP和微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein2, MAP2)等基因上的表达明显增加,实验结果显示BDNF修饰的骨髓间充质干细胞能在体内表达目的基因,促进脊髓损伤区域神经丝-200的表达。PRP复合BDNF修饰的骨髓间充质干细胞能促进脊髓损伤区域星型胶质细胞的生长及迁延,减少星型胶质细胞在脊髓损伤交界处堆积,PRP复合BDNF-MSC组8周后BBB功能评分明显高于其他各组,星型胶质细胞贯穿整个脊髓损伤区域,将损伤近端和远端连接起来,5-HT阳性神经纤维呈串珠样线性排列。[结论]：1.构建携带大鼠脑源性神经生长因子的腺病毒载体(Adv-BDNF-EGFP),转染BMSC并获得持续表达BDNF的BMSC。2.制作了PRP凝胶支架,并在体外证实PRP能促进BMSC和BDNF-MSC向神经细胞和星型胶质细胞方向分化。3.在体内半横段脊髓损伤模型上证实PRP复合BDNF修饰的骨髓间充质干细胞能促进脊髓损伤区域星型胶质细胞的生长及迁延,减少星型胶质细胞在脊髓损伤交界处堆积,促进脊髓损伤后运动功能的恢复,其机制可能与促进损伤区域5-HT能神经元的再生有关。