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目的:1.构建转化生长因子-β2(transforming growth factor,TGF-β2)诱导的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells,HLECs)发生上皮间质转分化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的细胞模型,检测细胞中长链非编码RNA HOTAIR(lnc RNA HOTAIR)的表达。2.探讨HOTAIR在TGF-β2诱导的HLECs增殖、迁移、EMT过程中的作用。3.检测TGF-β/Smad通路主要信号分子在TGF-β诱导人晶状体上皮细胞EMT过程中的表达变化及HOTAIR是否通过TGF-β/Smad通路在晶状体上皮细胞EMT过程中发挥作用。方法:1.构建TGF-β2诱导的人晶状体上皮细胞EMT的细胞模型,检测SRA01/04细胞中HOTAIR的表达。常规体外培养人晶状体上皮细胞株SRA01/04,用10 ng/ml TGF-β2处理细胞24小时后,用倒置显微镜观察细胞形态变化,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、免疫印迹(western blot)检测HLECs中EMT相关标记物基因及蛋白的表达,如上皮细胞标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白-1(zonula occluden-1,ZO-1)及间质细胞标志物波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)。应用qRT-PCR检测TGF-β2(10 ng/m L)不同作用时间(0小时,12小时,24小时,48小时,72小时)对晶状体上皮细胞HOTAIR的表达影响。2.下调HOTAIR的表达,探讨HOTAIR在HLECs增殖、迁移中的作用。应用RNA小干扰技术,在SRA01/04细胞中转染si HOTAIR-1、si HOTAIR-2和si HOTAIR-3及对照组si NC,并检测转染效率,细胞活力和增殖能力分别通过CCK-8和EDU实验检测,Transwell迁移试验用于细胞迁移能力的检测。3.观察HOTAIR在TGF-β2诱导的HLECs增殖、迁移、EMT过程中的作用,检测EMT相关转录因子的表达变化。细胞分为四组:si NC组:细胞中转染si NC,常规培养HLECs(SRA01/04)24小时;si HOTAIR:细胞中转染si HOTAIR,常规培养HLECs(SRA01/04)24小时;si NC+TGF-β2组:细胞中转染si NC,培养基加入10ng/ml TGF-β2,培养24小时;si-HOTAIR+TGF-β2组:细胞转染si HOTAIR,培养基培养加入10ng/ml TGF-β2,培养24小时。应用倒置显微镜检测观察细胞形态,免疫荧光、western blot检测EMT相关蛋白(E-cadherin、ZO-1、vimentin、α-SMA)的表达,western blot检测转录因子ZEB1、Snail、Slug的表达,细胞活力和增殖能力分别通过CCK-8和EDU实验检测,Transwell迁移及划痕试验同时用于细胞迁移能力的检测。4.TGF-β/Smad通路主要信号分子在TGF-β2作用下HLECs中的表达。下调SRA01/04细胞HOTAIR的表达,检测TGF-β/Smad通路蛋白的表达变化。10 ng/ml TGF-β2作用细胞后,western blot检测TGF-β2作用下HLECs中磷酸化Smad2,Smad3及总的Smad2,Smad3表达水平的变化,SRA01/04细胞转染si HOAIR或si NC,10 ng/ml TGF-β2作用细胞后,western blot检测HLECs中p-Smad2,Smad3及总的Smad2,Smad3表达水平的变化。结果:1.成功构建TGF-β2诱导的人晶状体上皮细胞EMT的细胞模型,细胞中HOTAIR的表达增加。倒置显微镜观察发现与对照组相比(未被TGF-β2处理),TGF-β2处理的实验组细胞发生EMT转变,细胞由原来的椭圆形变为长梭状。qRT-PCR、Western blot检测TGF-β2诱导SRA01/04细胞上皮间质转分化,结果发现:与未经TGF-β2处理的对照组相比,实验组的SRA01/04细胞上皮细胞标志物E-cadherin、ZO-1表达降低,间质细胞标志物vimentin、α-SMA表达增加,差异有显著统计学意义(P<0.01)。qRT-PCR技术检测TGF-β2作用不同时间晶状体上皮细胞HOTAIR的表达,结果发现TGF-β2作用12h,HOTAIR表达开始增加,48h达到最高值,差异有显著统计学意义(P<0.01)。2.成功筛选沉默HOTAIR的si HOTAIR,沉默晶状体上皮细胞HOTAIR的表达可以抑制HLECs存活、增殖及迁移。qRT-PCR技术筛选结果显示:与对照组相比,si HOTAIR-2和si HOTAIR-3可有效沉默HOTAIR的表达(*P<0.05,**P<0.01),差异具有统计学意义。最终选择si HOTAIR-3行进一步实验。SRA01/04细胞转染si HOTAIR,CCK-8、EDU、Transwell迁移实验检测结果显示:与对照组相比,下调SRA01/04细胞HOTAIR的表达,细胞存活能力、增殖能力及迁移能力明显下降(P<0.01),差异具有统计学意义。3.沉默HOTAIR的表达,抑制TGF-β2诱导的HLECs增殖、迁移、EMT过程,同时减少TGF-β2诱导的EMT相关转录因子的上调。倒置显微镜观察发现:与对照组相比(未被TGF-β2处理),TGF-β2处理的实验组细胞由原来的椭圆形变为长梭状,沉默HOTAIR以后,可以逆转细胞形态的变化。细胞免疫荧光法及western blot检测发现:经TGF-β2处理24h后,si NC+TGF-β2组细胞较si NC组组相比,E-cadherin、ZO-1表达降低,Vimentin及α-SMA表达增加(P<0.01);经si HOTAIR-3沉默后,si HOTAIR+TGF-β2组较si NC+TGF-β2组相比细胞E-cadherin、ZO-1表达增加,Vimentin及α-SMA表达降低(P<0.01),差异具有统计学意义。western blot检测发现:si HOTAIR组较si NC组细胞Snail,Slug and ZEB1的表达明显下降(P<0.01),差异具有统计学意义;si NC+TGF-β2组较si NC组细胞Snail,Slug and ZEB1的表达明显表达明显增加(P<0.01),差异具有统计学意义;si HOTAIR+TGF-β2组较si NC+TGF-β2组细胞Snail,slug and ZEB1的表达明显下降(P<0.01),差异具有统计学意义。CCK-8、EDU、划痕实验及Transwell迁移实验结果发现:si HOTAIR组较si NC组细胞存活能力、增殖能力、迁移能力降低(P<0.05);si NC+TGF-β2组较si NC组细胞存活能力、增殖能力、迁移能力降低明显增加(P<0.01);si HOTAIR+TGF-β2组较si NC+TGF-β2组细胞存活能力、增殖能力、迁移能力降低明显下降(P<0.01),差异具有统计学意义。4.TGF-β/Smad通路主要信号分子参与TGF-β2诱导晶状体上皮细胞EMT过程,HOTAIR通过TGF-β/Smad通路在晶状体上皮细胞EMT过程中起作用。Western blot免疫印迹结果显示,与对照组相比,TGF-β2处理组SRA01/04细胞中磷酸化的Smad2、Smad3表达水平增加,P<0.01,差异具有统计学意义。si HOTAIR组较si NC组SRA01/04细胞中p Smad2、p Smad3表达水平降低,经TGF-β2处理的si NC+TGF-β2组较si NC组SRA01/04细胞中p Smad2、p Smad3表达水平增加,经si HOTAIR-3沉默后,si HOTAIR+TGF-β2组较si NC+TGF-β2组p Smad2、p Smad3表达水平降低。结论:1.10ng/ml TGF-β2成功诱导人晶状体上皮细胞EMT细胞模型,细胞HOTAIR表达上调。2.沉默HOTAIR的表达抑制HLECs存活、增殖及迁移。3.HOTAIR参与TGF-β2诱导的HLECs存活、增殖、迁移及EMT过程,提示HOTAIR可能在后发性白内障(posterior capsule opacification,PCO)病理机制中扮演重要角色,但本研究缺乏体内研究,未来尚需进一步完善。4.HOTAIR通过TGF-β/Smad通路促进HLECs存活、增殖、迁移及EMT过程。