论文部分内容阅读
淀粉经过人体代谢消化产生终产物葡萄糖的过程涉及到一系列的α-糖苷酶类，如唾液淀粉酶（HSΑ），胰腺淀粉酶（HPΑ），麦芽糖苷酶（maltase-glucoamylase,MGΑM），蔗糖糖苷酶（sucrose-isomaltase,SI）等。而α-糖苷酶抑制剂（α-glycosidase inhibitor，ΑGI）可以抑制最终产物葡萄糖的产生，从而抑制餐后高血糖，对于2型糖尿病有很好的治疗效果。通过研究α-糖苷酶抑制剂与靶点α-糖苷酶间的作用机理不仅可以深入了解酶分子的作用方式并且有助于开发设计更高药效的α-糖苷酶抑制剂类药物。本研究首先从淀粉的α-1,4糖苷键内切相关酶类的克隆、表达入手，成功构建人胰腺淀粉酶（HPΑ），麦芽糖苷酶N端结构域（MGAM-N）,麦芽糖苷酶C端结构域（MGAM-C）的毕赤酵母表达菌株，分别命名为HPA-GS115，MGAM-N-GS115，MGAM-C-GS115。首次报道了人MGAM-C蛋白的克隆表达，使得同时研究HPA，MGAM-N与MGAM-C的性质成为可能。随后利用不同的蛋白纯化方法，如糖原沉淀、疏水层析、金属离子亲和层析、离子交换层析和分子排阻层析等成功获得了高纯度的HPA、MGAM-N和MGAM-C重组蛋白，其酶活力分别为136.5U/mg、5.15U/mg和20.23U/mg。分别以HPA、MGAM-N和MGAM-C重组蛋白为材料，在酶学水平研究其在糖代谢途径中的催化作用。通过不同的α-葡萄糖苷酶抑制剂对HPA、MGAM-N和MGAM-C的抑制情况来分析HPA、MGAM-N和MGAM-C的催化特异性、底物特异性以及对不同α-葡萄糖苷酶抑制剂的耐受性。使我们对α-糖苷酶抑制剂的抑制能力在整体轮廓上有更深刻的认识。研究结果表明，1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojimycin, DNJ）是MGAM最有效的抑制剂，其对两个催化结构域MGAM-N和MGAM-C的Ki值分别达到了1.41和2.04μM。而阿卡他定类化合物Acarviostatin2-03和3-03（A2-03，A3-03）是HPA的最佳抑制剂，Ki值分别为15和14.3nM。A2-03，A3-03同时也对MGAM-C显示出相对较高的抑制活性，其Ki值分别为6.02μM和6.08μM。研究发现，尽管MGAM-N和MGAM-C结构同源性很高，但它们具有不同的底物特异性以及α-葡萄糖苷酶抑制活性。以高纯度的HPA为材料获得高分辨率的A1-03，A2-03，A3-03，A4-03与HPA的复合晶体。结构生物学分析表明，A1-03具备与acarbose类似的重排模式。A1-03在HPA活性中心经历了一系列的水解和缩合反应，最终产生6个糖环的重排产物占据HPA的活性中心。与此同时，A2-03，A3-03和A4-03只进行水解反应，最终以7个糖环的终产物占据HPA活性中心。结合结构生物学与酶学动力学分析表明：经水解和重排修饰的7个糖环的终产物是最适合HPA活性中心的抑制剂结构，显示了最强的抑制效果。同时高分辨率的晶体结构首次显示了acarviostatins中A2-03，A3-03，A4-03抑制剂的重排产物与HPA活性部位的-4位点均发挥作用，从而能更好的抑制HPA的催化活性，为新型HPA靶标药物分子设计提供重要靶点信息。同时，本论文首次解析了MGAM-C以及与acarbose复合晶体结构。结果显示acarbose分子结合于MGAM-C催化活性中心部位，占据-1到+3位点，acarviosine单元中的N-连接糖苷键占据催化中心的-1到+1位中间部位。酶学动力学研究表明：MGAM-N对G2至G6的糖环底物具有类似的结合常数。但MGAM-C对G3至G6糖环底物有更强的亲和能力，而对于麦芽糖（G2）的亲和能力则较低。这表明MGAM-N和MGAM-C活性中心对于不同长度底物存在选择性。而通过Dpn1介导了活性位点的定点突变获得了MGAM-N-Y299W，MGAM-C-Y1251W和MGAM-C-deltaS毕赤酵母表达突变菌株。突变体酶活性分析结果显示：酪氨酸（Y1251W）到色氨酸的突变赋予了MGAM-C酶分子水解α-1,6糖苷键能力；MGAM-C结构中存在的21个额外的氨基酸赋予了其对长底物片段更好的偏好性；而敲除此段序列后其底物特异性与MGAM-N非常类似，这在一定程度上解释了MGAM-N，MGAM-C和SI-N不同的底物特异性的分子机制。本研究利用毕赤酵母表达系统分别克隆表达并纯化了HPA、MGAM-N和MGAM-C重组蛋白，研究其酶学性质以及与不同α-糖苷酶抑制剂的相互作用关系，并获得acarviostatin1-03，2-03，3-03，4-03与HPA的复合晶体，以及MGAM-C与Acarbose的晶体结构。对人体内淀粉中α-1,4糖苷键水解相关酶类进行了较全面的研究。这些研究结果基本阐明了acarviostatin类药物与HPA的作用机制，明确了MGAM-C活性位点与Acarbose间作用方式，为以α-糖苷酶为靶点的降糖新药设计与开发奠定了基础。