重组人纤溶酶原K5在毕赤酵母中的表达、纯化及其抗肿瘤新生血管生成基因治疗

来源 :复旦大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:baichunbo
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
肿瘤新生血管生成(tumor angiogenesis)是肿瘤的标志之一,在肿瘤的生长、转移等生物学过程中有重要作用。抗肿瘤新生血管生成的药物和基因治疗正在进行实验和临床研究,初步结果表明该疗法能有效地抑制肿瘤生长、转移,具有广阔的应用前景。已发现多种内源性的新生血管生成抑制因子如Angiostatin、Endostatin等,能特异地抑制内皮细胞增殖、迁移和新生血管生成,并显示较强的抗肿瘤生长和转移作用。Angiostatin是纤溶酶原的降解片段,主要结构为纤溶酶原分子的4个K(kringle, K)结构域,是抑制新生血管生成的关键性结构。纤溶酶原K1-3结构域,K5结构域等均能抑制新生血管生成,K5结构域具有很强的抑制内皮细胞增殖、迁移和新生血管生成等作用。为深入研究人纤溶酶原K5结构域(K5)的抗新生血管生成作用,我们利用重组DNA技术,在毕赤酵母表达系统中表达K5 cDNA克隆,鉴定其生物学活性;同时构建了含K5 cDNA基因的真核表达质粒pcDNA3K5和重组复制缺陷性腺病毒(Ad-K5)重组病毒颗粒,研究其对内皮细胞增殖、管腔形成的抑制作用,并用于实验性抗肿瘤新生血管生成基因治疗,取得了令人鼓舞的结果。一、 人纤溶酶原K5结构域cDNA基因在毕赤酵母中的表达、纯化应用PCR方法,扩增人纤溶酶原K5 cDNA基因,与分泌型酵母表达载体pPIC9K5重组后,转化甲醇营养型毕赤酵母(Pichia pastoris),筛选获得的重组转化子,甲醇诱导表达,表达产物经纯化后,用内皮细胞增殖抑制实验,证实其生物学活性。本实验构建的含K5 cDNA基因的重组分泌型酵母表达质粒pPIC9KK5在α-factor信号肽序列中仅保留了一个Kex2蛋白酶水解位点,以获得N端均一的重组K5蛋白(rh-K5),重组质粒转化酵母后,得到的转化子经甲醇诱导表达后,表达产物经SDS-PAGE和Wester Blot证实含有目的蛋白rh-K5,经纯化后,得到的rh-K5对牛毛细血管内皮(bovine capillary endothelial, BCE)细胞增殖有抑制作用,促进内皮细胞凋亡,但对细胞周期无明显影响。<WP=5>二、人纤溶酶原K5结构域基因转染体外实验应用PCR方法,将人纤溶酶原信号肽序列引入K5 cDNA基因,与真核表达载体pcDNA3重组,筛选得到重组克隆pcDNA3K5,脂质体法转染人乳腺癌细胞MDA-MB-231,G418筛选阳性克隆,PCR、RT-PCR和Western-Blot鉴定K5表达;将pcDNA3K5与穿梭质粒pShuttle重组,获得的重组克隆pShuttlek5与复制缺陷型腺病毒DNA重组,转化E.coli:DH5α,获得重组复制缺陷型腺病毒K5质粒DNA(pAd-K5),将其转染HEK293细胞,在其中包装、扩增制备重组复制缺陷型腺病毒K5(Ad-K5)。检测稳定表达rh-K5的MDA-MB-231细胞培养上清对BCE和人脐静脉内皮细胞EVC304增殖的抑制作用;Ad-K5感染BCE和ECV304细胞,观察其对两种内皮细胞增殖和管腔形成的影响。PCR扩增产物与pcDNA3重组后得到的克隆经酶切鉴定、测序确证,表明人纤溶酶原信号肽序列与K5 cDNA基因正确融合,将其转染MDA-MB-231细胞,筛选得到的阳性克隆,经PCR、RT-PCR和Westrn Blot检测表明,目的基因重组入细胞染色体,并能表达和分泌rh-K5。将稳定表达rh-K5的MDA-MB-231细胞培养上清作用于BCE和ECV304细胞后,对两者增殖有抑制作用,而其自身的增殖无明显影响;将pcDNA3K5与pShuttle重组得到的克隆pShttleK5与复制缺陷型腺病毒DNA重组,转化DH5α得到重组克隆pAd-K5,转染HEK293细胞,在其中包装、扩增后制备Ad-K5,将其感染BCE、ECV304细胞和MDA-MB-231细胞,对BCE和ECV304细胞增殖有抑制作用,并抑制BCE和ECV304细胞形成毛细血管样管腔结构,对MDA-MB-231细胞增殖无明显影响。三、 人纤溶酶原K5 结构域基因转染动物实验将稳定表达rh-K5的MDA-MB-231细胞在体外培养、扩增后接种至BALB/c nu/nu裸小鼠皮下,制备裸鼠乳腺癌模型,观察转染pcDNA3K5对肿瘤生长的影响,测肿瘤体积,绘制生长曲线,接种后30d,处死动物,测瘤重,RT-PCR检测K5 mRNA表达;免疫组化:VIII因子相关性抗原(factor VIII related antigen, FVIIIRAg)标记血管内皮细胞,计数肿瘤微血管,检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、凋亡相关蛋白Bcl-2和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的表达。与未转染和转染pcDNA3的MDA-MB-231细胞比较,转染pcDNA3K5的MDA-MB-231细胞在裸小鼠皮下生长延缓,肿瘤体积较小,瘤重较轻,其差别有统计学意义(P<0.01),RT-PCR检测表明K5 mRNA表达;计数肿瘤微血管发现转染pcDNA3K5组的微血管数较少(P<0.01);转染pcDNA3K5组VEGF和Bcl-2的表达<WP=6>降低(P<0.05),PCNA的表达无明显变化(P>0.05),说明rh-K5通过抑制肿瘤新生血管生成抑制肿瘤生长。上述结果表明,通过基因工程制备的新生血管生成抑制因子rh-K5具有生物学活性,可用于进一步的实验和临床研究;对其结构进行改造,可能获得活性更强的新生血管抑制因子;用病毒或非病毒载体进行K5抗肿瘤新生血管生成基因治疗也可能取得抗肿瘤效果。
其他文献
南疆光热资源充足,但水资源短缺,严重制约了农业的发展.为此,连续5 a(年)对香梨园进行了生草覆草试验.结果表明,覆草能显著提高香梨产量和品质,5 a(年)间的年均增产幅度为15.
玉露香梨是山西省农科院果树研究所以库尔勒香梨为母本、雪花梨为父本杂交选育而成的新品种,已通过山西省品种审定和山西省科技厅成果鉴定。该品种果面光滑,富有蜡质,8月下旬至9
在“互联网+”环境下,学生的学习环境和学习要求都发生了很大的变化,提高学生的网络自主学习能力迫在眉睫。高职英语教学要充分利用“互联网+”环境,根据网络自主学习的特点,
“金吉李”是从济源“黄甘李”芽变中选育出来的李新品种,2006年2月通过河南省林木品种审定委员会审定。    特征特性    树姿半开张,树冠圆头形或半圆形,主干粗糙,树皮纵裂,灰褐色。枝条较密,多年生枝褐色,一年生枝棕红色,光滑无毛。叶片长卵圆形,黄绿色,有光泽。花芽鳞片棕褐色,花白色。树势中等,萌芽率高,成枝力强。初结果树以长果枝结果为主,进入盛果期后以短果枝和花束状果枝结果为主,采前落果轻,
幼龄及初结果期的杏树一般生长旺盛,树冠扩大迅速,新梢生长量大。并常抽生二三次枝。此期修剪应兼顾整形和结果两个方面。对主、侧枝延长枝要轻剪长放.一般留全枝长的2/3进行短截
化学学科深度学习旨在通过具有化学学科特色的挑战性任务,促进学生化学学科核心素养的发展。指向深度学习的化学教学设计是单元学习主题统领的单元整体教学设计,具体包括:确